木通皂苷D在不同pH值和溫度下的穩定性

徐國防 李 爽 劉長纓 李曉蘇

1.鄭州人民醫院醫務科，河南鄭州 450003；2.河南省人民醫院呼吸內科，河南鄭州 450000

木通皂苷D在不同pH值和溫度下的穩定性

徐國防1李 爽1劉長纓1李曉蘇2▲

1.鄭州人民醫院醫務科，河南鄭州 450003；2.河南省人民醫院呼吸內科，河南鄭州 450000

目的研究木通皂苷D在不同的pH值和溫度下的穩定性。方法 采用高效液相色譜法測定不同pH值的磷酸鹽緩沖液中木通皂苷D濃度。 結果 方法的精密度（相對標準偏差，RSD）≤6.4%，準確度（相對誤差，RE）≤±4.7%。木通皂苷D在中性和弱堿性的環境中比較穩定，但在強酸和堿性環境中易分解，其降解速率還隨溫度的升高而加快。結論 試驗表明木通皂苷D的降解具有pH值和溫度依賴性，其在室溫條件下的穩定性可以滿足分析測定的需求。

木通皂苷D；穩定性

木通皂苷D是中藥續斷中的主要有效成分之一，其含量達2%以上[1]。續斷具有預防和治療骨質疏松癥，促進骨愈合等療效[2]，最早見于《神農本草經》，其應用已有數千年的歷史[3-6]。此外，它還具有抗氧化、抗炎、免疫調節作用[7-8]。

木通皂苷D的分子結構中有一個酯鍵，而酯鍵常常是不穩定的，尤其是在酸性或堿性條件下，已有關于此酯鍵在220℃斷裂的報道[9]。見圖1。為了更好地理解其物理和化學性質，進一步研究和開發木通皂苷D和續斷藥材，本資料采用高效液相色譜法測定了木通皂苷D在不同pH值的磷酸鹽緩沖液中的降解速率，并考察了溫度對降解速率的影響。

圖1 木通皂苷D在220℃下的降解反應

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-10 AT型液相色譜儀（日本島津公司），SPD-10 A型紫外檢測器（日本島津公司），Anastar色譜工作站（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）。木通皂苷D對照品（批號：111685-200401）和β-谷甾醇對照品（批號：110851-200403）均購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈均為色譜純，其他為分析純。

1.2 溶液配制

緩沖溶液：0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液若干份，分別用磷酸溶液或氫氧化鈉溶液（11 mol/L）調節至 pH1.5、3.0、5.0、6.5、7.4、9.1 和 11.1，供試驗用。

木通皂苷D溶液：用pH為1.5的磷酸鹽緩沖液配制成含木通皂苷D 155 μg/mL的溶液若干份，分別于4℃、25℃、60℃、80℃水浴，每個溫度水平雙樣本分析。

內標溶液：將β-谷甾醇對照品溶解在甲醇中制成0.4 μg/mL的溶液，4℃保存備用。

1.3 色譜條件與系統適用性[10]

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈-水（20:35:45，v/v）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：205 nm；進樣量：20 μL；柱溫：室溫。

在上述色譜條件下試驗，理論塔板數按木通皂苷D和β-谷甾醇計算均不低于4 000，且無雜質峰干擾。

空白樣品溶液試驗：不含木通皂苷D和β-谷甾醇的磷酸鹽緩沖液進樣后色譜圖見圖3（A），可見，空白樣品中在被測組分峰位上沒有吸收峰，故對測定無干擾。在該條件下的典型色譜圖見圖2（B、C）。

1.4 測定方法驗證

圖2 木通皂苷D典型色譜圖：（A）空白樣品；（B）空白樣品添加木通皂苷D（100 μg/mL）和內標（β-谷甾醇，0.4 μg/mL）；（C）pH為5.0的樣品溶液在37 ℃水浴24 h后進樣的色譜圖

在上述條件下，木通皂苷D的線性范圍為10～250 μg/mL，典型的線性方程為：Y=7.0×10-3X+1.8×10-2，r=0.998 6。木通皂苷D的定量下限（LLOQ）為2μg/mL。用低、中、高濃度分別為10、50、250μg/mL的質量控制樣品溶液驗證方法的日內和日間精密度（n=18），結果，其相對標準偏差分別≤5.9 %和6.4%（n=6）。方法的相對誤差在±4.7 %范圍內。

2 結果

2.1 酸度的影響

木通皂苷D在從1.5到11.1不同pH值的磷酸鹽緩沖液中放置一定的時間，抽取適量測定，計算其濃度的自然對數值，繪制降解曲線，見圖3。

圖3 37℃下，木桶皂苷D在不同pH值溶液中的降解曲線

可見，在中性和弱酸性條件下，木通皂苷D是穩定的，37℃24 h內木通皂苷D的濃度幾乎不下降。當pH值從6.5上升或者下降時，木通皂苷D的穩定性逐漸變差，在pH值1.5和11.1時，其t0.9分別為70.2 h和65.8 h。木通皂苷D在強酸和強堿條件下比中性和弱酸性條件下降解速率快，這與其他多數酯類相似。

2.2 溫度的影響

pH1.5的緩沖溶液中，木通皂苷D在不同溫度條件下放置一定時間，抽取適量測定，計算其濃度的自然對數值，繪制降解曲線。見圖4。

可見，木通皂苷D隨著溫度的升高降解速率加快，而且在整個試驗溫度范圍內，阿倫尼烏斯降解曲線基本為一條直線（r=0.999 6）。試驗表明，溫度能夠影響木通皂苷D的穩定性，且低溫條件下更穩定。

圖4 pH1.5下，木桶皂苷D在不同溫度條件下的降解曲線

3 討論

川續斷的主要結論成分是三萜皂苷，現已分離鑒定出23種三萜皂苷[11]。本資料采用高效液相色譜法測定木桶皂苷D，并用內標法進行定量分析，內標物在測定前即加入，不受存放條件的影響，分析方法準確可靠。有文獻[9]報道木桶皂苷D在220℃酯鍵斷裂，生成新的化合物，但在本資料所述試驗條件下的降解產物沒有確認，有待進一步研究。此外，使用不同加工方法處理續斷，其中的皂苷D含量發生變化[12]，而本資料只考察了水溶液中木桶皂苷D的穩定性，這是因為本研究的目的是為藥代動力學研究建立分析方法時做參考，也僅考察了溫度和pH值對其穩定性的影響，這是由于二者是溶液中物質穩定性的最重要和最常見的影響因素，限于時間關系，沒有進一步考察其他的影響因素。

[1]國家藥典委員會.中國藥典一部[S].北京：化學工業出版社，2000：231.

[2]楊中林.木通皂苷D在制備防治骨病藥物中的應用：中國，1209116[P].2005年7月6日.

[3]程志安，吳燕峰，黃智清，等.續斷對成骨細胞增殖、分化和細胞周期的影響 [J].中醫正骨，2004，12（16）：705-707.

[4]石印玉.續斷提取物治療原發性骨質疏松癥的多中心臨床研究[C].中華醫學會第三次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議暨骨質疏松診斷技術繼續教育學習班論文匯編.杭州：中華醫學會，2004：101.

[5]卿茂盛，鄒志鵬.續斷對大鼠骨質疏松愈合影響的生物力學實驗研究[J].中國醫學物理學雜志，2002，19（3）：159-160.

[6]鄭志永.續斷苷對人成骨細胞增殖和分化作用研究[J].山東中醫藥大學學報，2006，30（5）：388-389.

[7]程桂芹，孫少敏，王曉艷.川續斷對D-半乳糖所致衰老模型小鼠抗氧化系統影響的實驗研究[J].黑龍江醫學科學，2001，24（5）：14-15.

[8]何雪心，裘軍.續斷提取物對小鼠D-半乳糖擬疾呆型的抗氧化作用[J].中國藥師，2005，8（3）：185-187.

[9]Ryuichi Higuchi，Yoichi Kitamura，Tetsuya Komori.Thermal Degradation of Glycosides, I.Degradation of Typical Triterpenoid and Steroid Glycosides[J].Liebigs Annalen der Chemie，1986，1986（4）：638-646.

[10]高慧敏，王智民，付雪濤，等.RP-HPLC測定木通藥材中皂苷類成分的含量 [J].中國藥學雜志，2007，42（01）：20-23.

[11]王巖，周莉玲，李銳 .川續斷的研究進展 [J].時珍國醫國藥，2002，13（04）：233-234.

[12]楊尚軍 吳知行.川續斷中三萜皂苷的研究[J].中國藥科大學學報，1993，24（5）：272.

Stability of akebia saponin D at different pH value and temperatures

XU Guofang1 LI Shuang1 LIU Changying1 LI Xiaosu2
1.Medical department, People's Hospital of Zhengzhou City, Zhengzhou 450003, China; 2.Department of respiratory medicine, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450000,China

Objective Stability of akebia saponin D was investigated in sodium phosphate buffers with different pH value and temperature.Methods Akebia saponin D in sodium phosphate buffers with different pH value and temperature was quantified using a high-performance liquid chromatography method.Results The precision of the method was within 6.4%(RSD) and the accuracy was within ±4.7%(RE).The akebia saponin D was stable in neutral and weak acidic conditions,but decomposed under strong acidic and basic conditions, which was pH- and temperature-dependent.Decomposition rate speeded up with the rise of temperature.Conclusion The results showed that the decomposition of akebia saponin D was pH- and temperature - dependent.The nine-tenths life is long enough for analyzing at room temperature.

Akebia saponin D;Stability

R914

B

2095-0616（2012）06-74-02

▲通訊作者

2012-02-01）