癌痛消顆粒對移植性肝癌模型大鼠肝癌及癌旁組織miRNAs的影響※

黃 峰 韋艾凌

(湖南中醫藥大學2010級博士研究生，湖南 長沙 410208)

原發性肝癌(primary liver cancer，PLC)是臨床上常見的惡性腫瘤之一，應用中醫藥治療主要以改善癥狀、提高生活質量、增強放化療藥物的敏感性等達到減毒增效作用，有著確切的臨床療效，日益在癌癥的治療中顯示出重要價值，已成為綜合治療中不可缺少的手段之一。開展中醫藥治療PLC的實驗研究將有助于進一步了解中醫藥治療的機制。癌痛消顆粒是廣西中醫藥大學第一附屬醫院韋艾凌教授在膈下逐瘀湯的基礎上加減而成的經驗方劑，本實驗擬采用癌痛消顆粒干預治療移植性肝癌模型大鼠后，通過實時定量PCR(RT-PCR)技術檢測微小核糖核酸(miRNAs)miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18 在肝癌及癌旁組織中的表達情況，以探討癌痛消顆粒治療PLC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD雄性大鼠70只，清潔級，體質量(200±20)g，取60只用于制作移植性肝癌大鼠模型，10只作為空白對照。斷奶Wistar雄性大鼠6只，清潔級，體質量50～70 g，用于癌細胞增殖傳代，每周傳代1次，形成癌性腹水后制作瘤細胞懸液，以供移植性肝癌造模之用。所有動物分籠飼養，飼養于廣西中醫藥大學第一附屬醫院清潔級動物實驗室。實驗大鼠均購于廣西醫科大學實驗動物中心，動物生產合格證號：SCXK2009-0002。

1.1.2 實驗瘤株 Walker-256癌肉瘤，保存在廣西中醫藥大學第一附屬醫院-80℃冰箱的瘤株，原購于武漢大學中國典型培養物保藏中心，為Walker-256腹水型Wistar大鼠，質量約80 g。

1.1.3 藥品 癌痛消顆粒由廣西中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心制備，主要藥物組成：白花蛇舌草、半枝蓮、赤芍藥、延胡索、香附、烏藥、黃芪、絞股藍、三棱、莪術、紅花、甘草，每克相當于原藥材生藥4.86 g;氟尿嘧啶注射液(5-Fu，上海旭東海普藥業有限公司，國藥準字H31020593)。

1.1.4 試劑 miRcute miRNA提取分離試劑盒、RNAstore樣品保存液均購自天根生化科技(北京)有限公司，逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、固相表面RNase清除劑均購自寶生物工程(大連)有限公司，RPMI-1640、高糖DMEM(Gibco公司)，低熔點瓊脂糖(Sigma公司)。

反轉錄、定量PCR引物與探針：Rat-miR-199a-5p 5'-CCCAGTGTTCAGACTACCTGTTC-3';Rat-miR-199a-3p 5'-ACAGTAGTCTGCACATTGGTTA-3';RatmiR-18 5'-TAAGGTGCATCTAGTGCAGATA-3由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

1.1.5 儀器設備 巴爾貝斯BBS-SDC凈化工作臺(濟南安賽醫療器械有限公司);Eppendorf5417R冷凍離心機;SIM-F140AY65制冰機;美國伯樂Gel Doc XR System全自動凝膠成像系統;DNA Engine Opticon熒光定量PCR儀(MJ Research，Incorporated);BSC-1500IⅡB2-X 生物安全柜(鄭州南北儀器設備有限公司);LT-1005臺式低溫恒溫槽(上海雙旭電子有限公司);K5500超微量分光光度儀(北京凱奧科技發展有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立模型 將70只SD大鼠隨機分為空白對照組10只和造模組60只，適應性喂養1周，空白對照組正常飼養，造模組采用肝內直視下直接注射法造模。方法：斷奶Wistar雄性大鼠6只，分別腹腔注入Walker-256癌肉瘤和瘤鼠腹水，形成腹水后分別抽取癌性腹水5 mL，以1 200 r/min的速度離心2 min，摒棄上清液，用0.9%氯化鈉注射液洗滌再次離心1次，取稀糊狀濃縮的瘤細胞懸液備用。實驗用SD大鼠術前禁食8～12 h，2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，麻醉成功后取仰臥位，用橡皮筋固定四肢于實驗板上，自劍突下沿腹正中剪去體毛，用2%碘伏和75%酒精消毒后，沿腹白線逐層切開約1.5 cm，暴露大鼠腹腔，輕壓大鼠胸腔，托出肝左外葉，用1 mL注射器先抽取空氣0.1 mL，再抽取濃縮的瘤細胞懸液0.05 mL，針頭與肝臟表面呈30°角斜刺入鼠肝左外葉約0.5～0.8 cm，緩慢注入瘤細胞懸液 0.05 mL 后繼續推入空氣0.03 mL，快速拔針以防止瘤細胞懸液順針道逆流，穿刺點用棉簽壓迫3～5 min，觀察無活動性出血后輕送肝臟還納腹腔，關腹。術后前3 d按10萬單位/(只·d)肌肉注射注射用青霉素鈉，于造模第7 d隨機抽取7只(空白對照組2只，造模組5只)大鼠處死取肝臟，通過病理組織學檢查證實造模成功。

1.2.2 動物分組及給藥方法 將剩余55只造模組大鼠隨機分成癌痛消顆粒高、中、低劑量組及5-Fu對照組、蒸餾水對照組，每組11只，空白對照組大鼠8只。于造模后第8 d開始對癌痛消顆粒高、中、低劑量組予癌痛消顆粒溶液(藥物濃度為0.6 g/mL)按 2 mL、1 mL、0.5 mL 灌胃給藥，每日2次，連續治療14 d后停藥;5-Fu對照組采用5-Fu按75 mg/(kg·d)腹腔注射治療，每隔2 d 1次，共5次;蒸餾水對照組予蒸餾水每日2 mL灌胃，連續治療14 d。各組均停藥24 h后頸椎脫臼處死大鼠，嚴格消毒后開腹取出癌塊和癌旁組織，迅速以液氮冷凍，放入-80℃冰箱冷藏待檢。空白對照組大鼠不進行造模及施加處理因素，在相同的觀察時間內進行正常飼養，供實驗結束時作空白對照用。

1.3 肝癌及癌旁組織miRNAs表達的檢測

1.3.1 肝癌及癌旁組織總 RNA的提取 參照 miRcute miRNA提取分離試劑盒說明進行操作，用miVanaTM miRNA Isolation Kit分離miRNA。將提取的RNA用1.2%瓊脂糖進行電泳(圖1)，用K5500超微量分光光度儀檢測濃度及純度。

1.3.2 逆轉錄 參照逆轉錄試劑盒說明書，應用TRIzol一步法分別提取組織和細胞中總RNA，逆轉錄得到cDNA。

1.3.3 擴增檢測 將miRNA逆轉錄成cDNA，進行實時定量PCR擴增和檢測。采用SYBR Green Ι染料法進行檢測，提取各樣本總RNA進行反轉錄，獲得的cDNA以5次方等比稀釋上機摸索最佳模板濃度和擴增效率。反應條件為 94 ℃ -30 s，95 ℃ -10 s，58 ℃ -20 s，60 ℃ -20 s，plate read，40cycles，解鏈曲線60～95℃，由軟件自動生成擴增曲線和熔解曲線并設定基線。從熔解曲線可見反應過程無引物二聚體和非特異擴增(圖2)，保證數據的可靠性。本次試驗數據統計采用2-ΔΔCt方法進行。

1.4 統計學方法 應用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

各組大鼠肝癌及癌旁組織miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表達的測定CT值比較 見表1。

表1 各組大鼠肝癌及癌旁組織miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表達的CT值比較 ±s

表1 各組大鼠肝癌及癌旁組織miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表達的CT值比較 ±s

與空白對照組比較，* P＜0.05;與蒸餾水對照組比較，△ P＜0.05;與5-Fu對照組比較，#P＜0.05;與癌痛消顆粒高劑量組比較，＆P＜0.05

組 別 n miR-199a-3p miR-199a-5p miR-18肝癌組織 癌旁組織癌痛消顆粒高劑量組 11 13.37±1.57＊△# 5.72±0.61＊△# 4.54±0.86＊△# 2.02±1.92＊△# 0.72±0.20＊△# 0.48±0.55＊△#肝癌組織 癌旁組織 肝癌組織 癌旁組織癌痛消顆粒中劑量組 11 18.08 ±1.50＊△#＆ 7.71 ±1.85＊△#＆ 7.67 ±1.7＊△#＆ 3.05 ±0.59＊△#＆ 0.08 ±0.35＊△#＆ 0.39 ±0.72＊△#＆癌痛消顆粒低劑量組 11 2.37 ±0.71＊△ 1.80 ±0，.53＊△ 1.27 ±0.311＊△ 1.09 ±0.651＊△ 0.91 ±0.421＊△ 0.46 ±0.731＊△5-Fu 對照組 11 2.02 ±1.23＊△ 1.72 ±0.63＊△ 1.25 ±0.38＊△ 1.43 ±0.48＊△ 0.86 ±1.03＊△ 1.43 ±0.67＊△蒸餾水對照組 11 0.48 ±0.03* 0.45 ±1.60* 0.50 ±0.08* 0.60 ±0.18* 3.48 ±1.04* 1.70 ±0.16*空白對照組1 ±0.56 1 ±0.29 1 ±0.21 8

由表1可見，癌痛消顆粒高、中、低劑量組及5-Fu對照組、蒸餾水對照組 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表達的CT值與空白對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05);癌痛消顆粒高、中、低劑量組及5-Fu對照組 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18 表達的 CT值與蒸餾水對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，癌痛消顆粒高、中劑量組與5-Fu對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，癌痛消顆粒低劑量組與5-Fu對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，癌痛消顆粒中劑量組與高劑量組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

目前PLC全球發病率呈上升趨勢，我國年發病率約為34/10萬人，每年新發病患者超過10萬，每年約有23萬人死于肝癌，約占全世界肝癌死亡數的45% ～53%［1］。PLC給患者、家庭及社會造成了極大的影響和負擔，因此PLC的診斷、治療和預防就顯得尤為重要。

PLC的發生、發展是多因素、多步驟的復雜過程，通過尋找PLC發生、發展的相關基因，了解PLC的分子遺傳學機制為PLC的診斷、個體化治療提供理論基礎已成為目前國內外醫學界研究的熱點。miRNAs是一類大約22 nt大小的保守非編碼小RNA，主要通過轉錄后對其靶基因表達進行負性調控［2］，以mRNA為靶標可在不同水平上調節基因表達，據推測miRNAs能夠調節人類1/3的基因，參與細胞發育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物學進程［3］。

目前已發現若干miRNAs直接參與肝細胞癌變的發生和發展，肝癌組織中miR-18、pre-miR-18及miR-22較正常組織有更高水平的表達，miR-199a、miR-195、miR-199a、miR-200a及miR-125a表達水平則降低，依據這些差異表達的miRNAs來區分癌變組織與正常組織的精確度可達到97%［4］。

中醫學認為，PLC屬肝積等范疇，是由于多種原因導致體內毒聚、血瘀、正虛的改變，日久導致毒結不通，血瘀不行，氣機升降出入失常，阻于脅下，繼而發病［5］。根據PLC“毒、瘀、虛”的病機特點，解毒、化瘀、扶正是其基本治法。膈下逐瘀湯出自清·王清任《醫林改錯》，具有活血化瘀、行氣止痛、破癥消積之功，主治膈下瘀阻氣滯，形成痞塊等，韋艾凌教授正是根據自己多年臨床經驗在原方基礎上加減而成癌痛消顆粒。方中以白花蛇舌草、半枝蓮為君，清熱解毒，散瘀止痛，直擊肝癌肇因;赤芍藥、延胡索、香附疏肝理氣，活血止痛，為臣藥;烏藥、黃芪、絞股藍、三棱、莪術清熱解毒，活血祛瘀，補脾益氣，養陰生精，散結止痛，為佐藥;紅花專入心、肝血分，活血通絡，甘草調和諸藥，共為使。諸藥合用，組方嚴謹，切合肝癌病機，可以攻補兼施、氣血同治、肝脾同調，具有祛邪不傷正、扶正不留邪的特點。

中藥一般是通過多種途徑、多個環節發揮抗癌作用，癌痛消顆粒為中藥復方制劑，藥味較多，成分復雜，有研究表明癌痛消顆粒可下調大鼠移植性肝癌的血管內皮生長因子(VEGF)和微血管密度(MVD)表達，具有一定抑制Walker-256移植性肝癌血管生成的作用［6］，還可以下調肝癌細胞bcl-2基因蛋白的表達，具有誘導凋亡作用［7］。為進一步探討癌痛消治療肝癌的機制，本實驗有針對性的引入觀察其對 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表達的影響。實驗研究結果表明，癌痛消顆粒各劑量組對肝癌及癌旁組織組織miRNAs的表達均具有調節作用，能夠降低miR-18的表達，升高miR-199a-3p、miR-199a-5p的表達，且以癌痛消顆粒中劑量組的療效最佳，其抗癌作用機制可能就與調節PLC的不正常miRNAs表達有關。

［1］王志偉，劉志平.肝臟腫瘤外科治療的研究與進展［J］.肝膽外科雜志，2011，19(1)：6-8.

［2］Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell 2004，116(2)：281-297.

［3］Ventura A，Jacks T.MicroRNAs and cancer：shortRNAs go a long way［J］.Cell，2009，136(4)：586-591.

［4］MurakamiY，Yasuda T，Saigo K，et al.Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues［J］.Oncogene，2006，25(17)：2537-2545.

［5］韋艾凌，唐健，陳逸恒，等.癌痛消顆粒治療原發性肝癌血瘀毒結兼正虛證療效分析［J］.遼寧中醫雜志，2007，34(5)：570-572.

［6］魏錄翠，韋艾凌，唐健，等.癌痛消顆粒調節大鼠移植性肝癌VEGF和MVD表達的實驗研究［J］.遼寧中醫藥大學學報，2008，10(8)：159-161.

［7］魏錄翠，韋艾凌，黃小琪.癌痛消顆粒對大鼠移植性肝癌細胞凋亡及Bcl-2表達影響的研究［J］.江西中醫學院學報，2008，20(3)：82-84.