調衡方對Lewis肺癌細胞凋亡標志物bax及bcl-2表達的影響※

張宏方 周雪寧 吳 芳 肖迎聰 環 誠 張怡敏 張程斐 劉啟玲

(陜西中醫學院分子病理學研究室，陜西 咸陽 712046)

1 廣西中醫藥大學2010級本科生，廣西 南寧 530001

許多腫瘤的分化、生長失控與其細胞內凋亡相關因子密切相關，尤其是肺癌對人類的健康危害顯得更為嚴重。研究表明腫瘤細胞無限增殖失控主要是其抑制凋亡的bcl-2基因及促進凋亡的bax基因失調而導致［1］。我們以前的研究表明，調衡方有較明顯的抗腫瘤轉移的作用，且可明顯減少轉移灶的數量和大小［2-4］。調衡方抗腫瘤轉移是否與 bax、bcl-2凋亡相關基因有關，仍未揭示清楚［2-4］。本研究以Lewis肺癌細胞內bax、bcl-2為對象，探討調衡方含藥血清對Lewis肺癌細胞內bax及bcl-2的影響，從而揭示調衡方對Lewis肺癌細胞凋亡的作用機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 溴化四唑藍(MTT)為Sigma公司產品;Trizol為美國 Amresco公司產品;bax、bcl-2、β-actin的PCR引物均由北京三博遠志生物技術有限公司合成，總RNA提取試劑盒(RNAfast200)購自上海飛捷生物科技有限公司。cDNA第一條鏈合成試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit)、實時定量試劑盒(SYBR Green-ROX qPCR Master Mix)均購自Fermentas(立陶宛)。二甲亞砜(DMSO)、胰酶(1∶250)(美國 Sigma 公司);RPMI-1640(Gibico)和胎牛血清(美國Hyclone公司)。細胞周期DNA含量檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)。

1.1.2 儀器 全自動酶標儀(美國 Bio-Tek ELX808IU);實時定量PCR儀(美國 Bio-Rad IQ5.0);全自動高壓滅菌器(日本三洋MLS-3780);倒置顯微鏡(奧特BDS-200);流式細胞儀(美國 Beckman CELL LAB QUANTA SC);CO2培養箱(美國Napco公司);超低溫冰箱(美國熱電702型)。

1.1.3 實驗動物 無特定病原體(SPF)雌性SD大鼠32只，二級，體質量(200±20)g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(陜)2007-001，置本室二級動物實驗室飼養。

1.1.4 細胞株 Lewis肺癌株購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.1.5 藥品 調衡方是由生黃芪、生山藥、白花舌蛇草、西洋參、天花粉、莪術、生雞內金、天門冬、水蛭等組成，諸藥均經過生藥學鑒定，符合《中華人民共和國藥典》(95年版)規定質量標準。將上述藥物經煎藥濃縮制取(每1 mL含生藥3 g)，分裝滅菌備用。AG490購自美國 Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清的制備 將SD大鼠32只隨機分為調衡方大、中、小劑量含藥血清組及正常血清組(各組給藥劑量相當于臨床等效劑量，依據文獻［5-7］方法計算人鼠等效劑量及制備含藥血清)，每組各8只，給藥劑量分別為32、18、9 g/kg及灌服等容積的0.9%氯化鈉注射液，分2次給予，連續給藥5 d，末次灌胃后禁食12 h，但不禁水，再給1 d的量，1 h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，心臟內采血，血液靜置后2 500 r/min離心后取血清，56℃水浴30 min滅活，用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌(在超凈工作臺上)，分裝于1.5 mL EP 管，-70 ℃冰箱保存備用［8］。

1.2.2 MTT法檢測調衡方對Lewis肺癌細胞生長的抑制作用 將Lewis肺癌細胞用0.25%胰蛋白酶消化，傳代至96孔板中，共5組，即調衡方含藥血清大、中、小劑量組、調衡方中劑量含藥血清+AG490溶液(25 μmol/L)組及正常血清組，每組設6個復孔，每孔接種1×104～2×104個Lewis肺癌細胞100 μL，另加100 μL核酸內切酶A(培養基，在37℃、5%的CO2培養箱中培養24 h。待細胞會合率達80% 時，分別加入不同濃度調衡方含藥血清10 μL及調衡方中劑量含藥血清+AG490溶液(25 μmol/L)，各孔加培養液至200 μL，還設只加培養液200 μL的空白孔與只加Lewis肺癌細胞懸液200 μL的對照孔(各種濃度均為6平行孔)。分別在24、48、72 h時取出1板，每孔再加5 mg/mL MTT 20 μL，繼續培養4 h。棄各孔內液體，每孔加入 DMSO 100 μL，振蕩 10 min，以 490 nm 為測定波長，630 nm為參比波長在全自動酶標檢測儀上測各孔吸光度值(OD值)。根據細胞生長抑制率公式：生長抑制率=(對照組 OD值 -用藥組 OD值)/對照組 OD值 ×100%，計算抑制率［9］。重復此實驗3次。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞周期與凋亡狀況 取對數生長期Lewis肺癌細胞，將培養液換成不同濃度的調衡方含藥血清溶液，繼續培養24 h。取不同濃度的調衡方含藥血清液24 h干預的Lewis肺癌細胞，同時設立陰性對照組，并用胰酶消化各組貼壁的Lewis肺癌細胞，且各組細胞收集好，在1 500 r/min離心5 min的條件下，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌Lewis肺癌細胞1次，調整Lewis肺癌細胞為1×106/mL的濃度。各組細胞液用70%乙醇固定且4℃存放，染色前用PBS洗去固定液，加100 μL核酸內切酶(RNase A)，37℃水浴中置30 min。再加 PI 400 μL混勻染色且于4℃避光30 min后上機檢測(記錄激發波長488 nm處紅色熒光)。各組樣品行DNA單參數含量分析(獲得2.0×104個細胞樣品)其 DNA含量。用軟件CellquestTM獲取數據，用軟件ModfitLT作圖并分析數據，測量凋亡的標準用定量亞二倍體峰。

1.2.4 RT-PCR 檢測 bcl-2、bax mRNA 的表達

1.2.4.1 提取總RNA(用 RNAfast 200) 將不同濃度的調衡方含藥血清24 h干預的Lewis肺癌細胞收集好，在培養皿中用1 mL裂解液裂解細胞后移至EP中，置室溫5 min且加氯仿200 μL混勻后，再置室溫5 min且4℃離心(12 000 g離心15 min)，轉移上層約400 μL水相放置于純化柱的內套管中，12 000 g離心1 min，棄去外套管中液體，加500 μL 75%的乙醇(DEPC：焦碳酸二酯處理并高溫滅菌的H2O配制)于內套管中，12 000 g離心1 min，再次離心1 min，棄去外套管，換1個干凈的EP管套在內套管上，在內套管的膜中央加洗脫提取液30 μL，在4℃放置5 min后，13 500 g離心1 min收集提取的總RNA。

1.2.4.2 兩步法實時 PCR逆轉錄反應 在0.2 mL PCR管中，加入總RNA 1 μg，補充適量的DEPC H2O使總體積達 11 μL。再加 10 μM Oligo(dT)12-18 1 μL，輕輕混勻、離心。65℃加變性5 min，立即將PCR管插入冰浴中冷卻2 min。然后依次加入下列成分：5 ×PCR buffer 4 μL，RNA酶抑制劑 1 μL，10 mM dNTPmix 2 μL，M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL，混勻瞬時離心，25 ℃，5 min，44 ℃，60 min，于70℃加熱5 min以終止反應，cDNA-20℃短期保存或者-70℃長期保存備用。第2步PCR反應：bcl-2 上游引物：5'-CGGGAGAACAGGGTATGATAAC-3'，下游5'-GGCTGGAAGGAGAAGATGC-3'，擴增產物大小為147 bp。bax上游引物：5'-TGCTACAGGGTTTCATCC-3'，下游 5'-CCAGTTCATCTCCAATTCG-3'，擴增產物大小為135 bp。actin上游引物序列：5'-ACCACACCTTCTACAATGAG-3'，下游 5'-ACGACCAGAGGCATACAG-3'，擴增產物大小為182 bp。25 μL的總體積(加入2 ×Syber Green預混Taq酶12.5 μL，加上下游引物至終濃度0.2 μmol/L，加入第 1 步反應得到的 cDNA 模板 1 μL，以DEPC H2O補足至25 μL，混勻)。每個樣品做2組副孔，實時上機檢測。擴增條件：第1步，50℃ 2 min;第2步，95 ℃ 10 min; 第3 步，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，收集熒光信號，在該階段擴增40個循環;第4步，做溶解曲線。經繪制標準曲線驗證，各個產物的擴增效率以目標基因與β-actin擴增產物的雙Delta-CT比值分析計算各個組的表達情況。

1.2.5 統計學方法 應用SPSS 11.0統計軟件分析處理實驗數據，計量資料用均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗。

2 結果

2.1 抑制Lewis肺癌細胞生長的增殖作用 不同劑量調衡方含藥血清干預的Lewis肺癌細胞24、48、72 h后，對Lewis肺癌細胞的增殖均有抑制作用，且隨著調衡方含藥血清藥物劑量的增加，Lewis肺癌細胞增殖抑制率亦增大(呈現出時間及濃度的依賴性)。提示調衡方含藥血清對Lewis肺癌細胞增殖有抑制作用。見圖1。

2.2 調衡方對Lewis肺癌細胞周期與凋亡的影響 見表1。

表1 調衡方對Lewis肺癌細胞周期與凋亡的影響%，±s

表1 調衡方對Lewis肺癌細胞周期與凋亡的影響%，±s

與正常血清組比較，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

組 別 藥物濃度(g/kg) G0期/G1期 G2期/M期 S期 凋亡率正常血清組48.86 ±1.77 9.82 ±0.91 39.32 ±2.27 1.23 ±0.21小劑量血清組 9 53.30 ±1.75 9.85 ±1.25 36.85 ±2.47 2.57 ±0.68中劑量血清組 18 55.31 ±0.96* 12.13 ±1.15 32.56 ±2.46* 8.97 ±1.27＊＊大劑量血清組 32 55.64 ±0.44＊＊ 12.96 ±1.52 31.40 ±0.93* 9.63 ±1.00＊＊中劑量血清 +AG490組 (18+25) μmol/L 59.36±0.41＊＊ 13.16±1.56 27.48±1.04＊＊ 10.10±0.63-＊＊

由表1可見，不同濃度的調衡方含藥血清干預Lewis肺癌細胞24 h后，其細胞凋亡率隨調衡方含藥血清藥物濃度的遞增而增加，且除小劑血清組外，調衡方含藥血清干預組與正常血清組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，尤其是中劑量含藥血清+AG490組作用非常顯著;而調衡方含藥血清對Lewis肺癌細胞周期的影響亦是隨調衡方含藥血清藥物濃度的增加，肺癌細胞S期減少或被阻滯(P＜0.05，P ＜0.01)，G0/G1 期有所延長(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3 調衡方對Lewis肺癌細胞凋亡相關基因bcl-2、bax mRNA的影響 見表2。

表2 調衡方對Lewis肺癌細胞凋亡調控基因bcl-2及bax mRNA的影響 ±s

表2 調衡方對Lewis肺癌細胞凋亡調控基因bcl-2及bax mRNA的影響 ±s

與正常血清組比較，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

組 別 藥物濃度(g/kg) bcl-2/β-actin bax/β-actin bax/bcl-2正常血清組0.979 ±0.036 0.778 ±0.030 1.259 ±0.014小劑量血清組 9 0.972 ±0.004 0.916 ±0.064 1.066 ±0.086*中劑量血清組 18 0.792 ±0.038* 0.97 ±0.042* 0.816 ±0.007＊＊大劑量血清組 32 0.705±0.034＊＊ 0.985±0.030＊＊ 0.715±0.016＊＊中劑量血清 +AG490組 (18+25)μmol/L 0.662±0.039＊＊ 0.988±0.001＊＊ 0.672±0.048-＊＊

由表2可見，不同濃度的調衡方含藥血清干預Lewis肺癌細胞24 h后，bcl-2 mRNA的表達量隨著藥物濃度遞加均有明顯下降，而bax mRNA的表達量呈上升趨勢，除小劑量血清組外，其余各組與正常血清組比較差異均有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。尤其是中劑量血清 +AG490組bcl-2 mRNA表達降低、bax mRNA表達上升更為顯著(P＜0.01)，說明調衡方與細胞信號轉導特異性抑制劑AG490聯合有相加作用。

3 討論

臨床研究發現，中藥復方制劑是中醫治療腫瘤的重要手段，許多中藥及其復方能提高機體免疫功能，增強放化療效果和減輕放化療的不良反應［2，10］，甚至某些中藥可直接抑制和殺傷腫瘤細胞，因而中藥及其復方抗腫瘤具有獨特優勢。bcl-2、bax是細胞內一對與凋亡密切相關的基因，bcl-2為抑制凋亡的基因，而bax為凋亡促進基因。bcl-2激活后通過細胞內一系列的天冬氨酸特異性的半胱氨酸酶的活化直接或間接抑制細胞的凋亡［11］。胞內的bax蛋白表達增加而促使細胞凋亡。若在細胞內的bax/bcl-2比值增加，使細胞內的線粒體發生一系列變化，最終導致Caspase級聯反應［8，12-13］，而促使細胞凋亡。本實驗用調衡方含藥血清干預Lewis肺癌細胞，發現調衡方含藥血清可促進肺癌細胞中bcl-2基因下調，bax mRNA表達提升，提示調衡方含藥血清可能通過提升bax/bcl-2比值而誘導肺癌細胞的凋亡。

通過調衡方含藥血清干預Lewis肺癌細胞，用RTPCR法測定肺癌細胞相關基因的變化表達，結果顯示，用藥后bcl-2可明顯下調，bax基因表達水平顯著上調。另外，通過調衡方含藥血清干預的Lewis肺癌細胞，其細胞周期時相分布改變(S期的比例隨著調衡方藥物劑量的增加而減少，G0/G1期比例而增加)，所以肺癌細胞增殖減慢。提示調衡方含藥血清對Lewis肺癌細胞凋亡的誘導部分機制可能與降低bcl-2表達及上調bax的表達有關，即通過升高bax/bcl-2比值，促進Lewis肺癌細胞凋亡，抑制細胞增殖。

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