針刺不同腧穴對失眠模型大鼠腦內神經遞質5-HT、DA影響的實驗研究*

周艷麗

(河南中醫學院針灸推拿學院，鄭州 450008)

睡眠占整個生命的三分之一，幾乎和食物同等重要。失眠給人們帶來的長期痛苦也越來越成為一個公共衛生問題［1］。隨著社會的發展，競爭日趨激烈、自然環境變化、生活節奏加快以及人口老齡化及疾病譜的改變，失眠的發病率急劇上升［2］。針灸治療失眠癥有悠久的歷史，有著豐富的經驗和良好的效果，具有見效快、作用穩定、費用低以及改善晨醒后伴隨癥狀明顯等非藥物療法的優點;且經過長期臨床檢驗已證實，針刺治療失眠療效確切、作用持久而穩定。但也存在著診療標準不統一、治療方法多樣化、選穴組方差異性較大、缺乏相關的實驗研究依據等問題。本實驗選取臨床中最常選用的申脈、照海、神門、內關、足三里和三陰交等穴位，觀察針刺上述腧穴對失眠大鼠腦內單胺類神經遞質5-HT、DA的影響，為臨床治療失眠選穴提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

對氯苯丙氨酸，吉爾生化(上海)有限公司;兔抗5-HT，武漢博士德生物公司;兔抗DA、SABC染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、枸櫞酸緩沖液、PBS緩沖液均由武漢博士德生物公司提供，其他試劑包括甲醛、H2O2、切片石蠟、二甲苯、乙醇等均由天津市福晨化學試劑廠生產;0.35mmx15mm針灸針，蘇州醫療用品廠;MP200A型電子天平，上海精密科學儀器有限公司;電熱恒溫干燥箱，黃石市恒豐醫療器械有限公司;KD-BM生物組織包埋機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司;輪轉式石蠟切片機，德國Leitz公司。

1.2 動物及分組

健康Wistar雌性大鼠 70只，體重 200g±10g，由鄭州大學實驗動物中心提供。將70只大鼠隨機分為模型對照組、空白對照組、神門組、內關組、三陰交組、足三里組、申脈、照海組7組，每組10只。

1.3 實驗方法

實驗前分籠飼養1周適應環境，自由進食飲水，室溫20℃～25℃，濕度40%～60%。對氯苯丙氨酸(PCPA)用弱堿性生理鹽水(PH7～8)配置成30mg/ml混懸液備用。除空白對照組外，其余6組大鼠于每日上午腹腔注射 PCPA混懸液 lml/100g，連續注射2d，空白對照組腹腔注射同體積的弱堿性生理鹽水。于第1次腹腔注射28h～30h后，動物出現晝夜節律消失，白天活動頻繁，與空白對照組有明顯不同，表明模型復制成功。大鼠腹腔注射PCPA造模成功后，于次日開始每天早晨8∶00～10∶00進行針刺治療，神門組選取神門，內關組選取內關，三陰交取三陰交、足三里組取足三里，申脈、照海組取申脈、照海，空白對照組及模型對照組只抓取不治療。針刺組參照李忠仁［3］主編的《實驗針灸學》選取相應腧穴，以0.5寸毫針進行針刺，平補平瀉捻轉1min出針，每日1次，連續7d。于末次針刺治療60min后對大鼠斷頭處死取腦。

1.4 觀察指標

(1)腦組織處理及切片:大鼠斷頭后迅速將腦取出，在冰床上操作，沿腦正中裂將大腦切為左右兩個半球，取右側腦組織放入4%的甲醛溶液中，4℃條件下固定1周后，行梯度脫水、透明、石臘包埋、切片，每張切片厚6um，進行測定指標的免疫組織化學法染色;(2)免疫組織化學染色:切片常規脫蠟至水，用 PBS(pH7.4)沖洗3次，每次 3min。切片入3%H2O2水溶液室溫10min，蒸餾水洗滌3次;切片入0.01M枸櫞酸緩沖液(pH6.0)微波加熱修復抗原，PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3min。滴加正常羊血清封閉，室溫下孵育30min，甩去血清分別滴加一抗(兔抗 5-HT、兔抗 DA)，4℃ 過夜。PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3min。滴加生物素化羊抗兔 IgG，室溫下孵育30min。滴加試劑SABC鏈酶親和素-過氧化物酶復合物，室溫下 30min。滴加新鮮配制的DAB溶液，鏡下控制反應時間。自來水沖洗后，蘇木素復染，上行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。陰性對照:用正常羊血清代替一抗;(3)鏡檢:每張切片分別至少觀察5個具有代表性的視野，顯微鏡觀察，顯示棕黃色顆粒者為陽性，計數每個視野中染色陽性的細胞數。

1.5 統計學處理

統計分析采用SPSS 13.0軟件進行。所得數據以均值±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05、P＜0.01作為顯著性和極顯著性差異的標準。

2 結果

2.1 各組大鼠腦內5-HT陽性細胞表達比較

表1顯示，干預后模型組與空白組相比，大鼠腦內5-HT免疫陽性細胞數量明顯減少，差異有顯著性意義(P＜0.05);針刺各組與模型組相比，大鼠腦內5-HT免疫陽性細胞數量明顯增多，差異有顯著性意義(P＜0.05);針刺各組與空白組相比，神門組、申脈、照海組、三陰交組大鼠腦內5-HT免疫陽性細胞數量明顯增多，差異有顯著性意義(P＜0.05);內關組、足三里組相比，大鼠腦內5-HT免疫陽性細胞數量差異無顯著性意義(P＞0.05);與神門組相比，申脈、照海組大鼠腦內5-HT免疫陽性細胞數量差異有顯著性意義(P＜0.05);與三陰交組、內關組、足三里組相比，大鼠腦內5-HT免疫陽性細胞數量增多，差異有顯著性意義(P＜0.05);與申脈、照海組相比，三陰交組、內關組、足三里組大鼠腦內5-HT免疫陽性細胞數量增多，差異有顯著性意義(P＜0.05);與三陰交組相比，內關組、足三里組大鼠腦內5-HT免疫陽性細胞數量差異有顯著性意義(P＜0.05)。

2.2 各組大鼠腦內DA陽性細胞表達的比較

表2顯示，干預后模型對照組與空白對照組相比，大鼠腦內DA陽性細胞數明顯增多，差異有顯著性意義(P＜0.05);模型組與針刺各組大鼠腦內DA陽性細胞數比較差異無顯著性意義(P＞0.05);針刺各組之間無明顯差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠腦內5-HT陽性細胞表達的比較(±s)

表1 各組大鼠腦內5-HT陽性細胞表達的比較(±s)

注:與空白對照組比較:★P＜0.05;與模型對照組比較:▲P＜0.05;與神門組比較:◆P＜0.05;與申脈、照海組比較:△P＜0.05;與三陰交組比較:◇P＜0.05

組別例數 5-HT陽性細胞表達空 白 對 照 組 10 23.00±5.00模 型 對 照 組 10 12.00±1.83★足 三 里 組 10 22.71±6.08▲◆△◇內 關 組 10 28.43±4.72▲◆△◇三 陰 交 組 10 37.14±7.54★▲◆△申 脈 、照 海 組 10 43.71±5.85★▲◆神 門 組 10 46.86±4.22★▲

表2 各組大鼠腦內DA陽性細胞表達的比較(±s)

表2 各組大鼠腦內DA陽性細胞表達的比較(±s)

注:與空白組比較:★P＜0.05

組別例數 DA陽性細胞表達空 白 對 照 組 10 15.71±2.06模 型 對 照 組 10 35.86±2.67★三 陰 交 組 10 33.00±2.88★足 三 里 組 10 34.57±4.89★內 關 組 10 35.57±3.87★申 脈 、照 海 組 10 38.00±3.37★神 門 組 10 38.71±3.64★

3 討論

睡眠具有明顯的隨晝夜而變更的時間節律性，衛氣晝夜運行節律失調是失眠的主要發病機制。此外，腦為元神之府，若髓海不足、腦失所養，人的思維、感知、睡眠狀態皆會出現障礙［4］。據統計，古代文獻中記載治療失眠涉及經脈7條，穴位多達65個［5］。

睡眠是中樞神經系統內發生的一個主動過程，與腦內神經遞質的動態變化密切相關［6］。5-HT、DA是大腦內單胺類神經遞質，5-HT參與如體溫調節、情緒活動、痛覺等多種生理功能的調節，對睡眠-覺醒的調節作用已被多項研究證實。5-HT的各受體亞型具有調節睡眠-覺醒周期的作用，激動突觸前5-HTIA自身受體，可延長 NREM(包括 SWS)，減少覺醒，對REM無明顯影響;激動突觸后5-HTIA受體，可抑制睡眠(包括REM和5WS)并促進覺醒。DA起著維持覺醒和行為興奮的作用。當各種原因使其維持覺醒和行為興奮的作用受到抑制時，亦可影響睡眠-覺醒周期［7］。

實驗結果表明，針刺各組對腹腔注射PCPA所致失眠大鼠的睡眠具有明顯的良性調節作用。針刺各組大鼠腦內5-HT含量有明顯升高，但對腦內DA的含量無明顯作用，提示針刺各組可能通過提高大鼠腦內5-HT含量、促進睡眠，而非抑制DA合成、抑制大腦興奮來調節睡眠-覺醒周期，達到治療失眠的目的。

實驗研究提示，針刺對失眠有良好的預防和治療作用。神門對5-HT的作用最好，申脈、照海治療失眠的作用僅次于神門，可作為臨床治療失眠的必選穴位。內關、三陰交、足三里對5-HT的作用，可作為臨床治療失眠且符合辨證的首選穴位。

［1］譚永江，王文龍.科學睡眠才能保證健康［N］.科學時報，2007-3-30(B02).

［2］周靜媛，王宗濤.疏肝解郁、養血活血法治療失眠癥體會［J］.中國中醫藥信息雜志，2002，9(8):2.

［3］李忠仁.實驗針灸學［M］.北京:中國中醫藥出版社，2003:327.

［4］任珊，孫偉霞.高希言教授針刺治療失眠經驗探討［J］.河南中醫學院學報，2008，23(3):49-50.

［5］劉立公，顧杰.難病針灸典籍通覽［M］.上海:上海科學技術出版社，2007:150.

［6］劉林方，等.保神開郁沖劑影響失眠鼠中樞遞質的實驗研究［J］.遼寧中醫雜，2000，27(2):92.

［7］劉彬，等.保神開郁沖劑影響失眠鼠中樞遞質的實驗研究［J］.遼寧中醫雜志，2000，27(2):92.