硫脲殼聚糖Zn(II)配合物的制備、表征及生物活性

馮小強，李小芳，楊 聲，張景峰

天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，天水741001

硫脲殼聚糖Zn(II)配合物的制備、表征及生物活性

馮小強*，李小芳，楊 聲，張景峰

天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，天水741001

利用FT-IR、UV、TG-DTA和XRD手段，對合成的硫脲殼聚糖及硫脲殼聚糖-Zn(II)配合物進行了表征，研究了殼聚糖、硫脲殼聚糖及硫脲殼聚糖-Zn(II)配合物對細菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和真菌黑曲霉的抑菌性能。結(jié)果表明:合成的硫脲殼聚糖-Zn(II)配合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性能比單一的殼聚糖、硫脲殼聚糖顯著提高，對真菌黑曲霉亦具有較強的抑制作用。

殼聚糖;硫脲殼聚糖-Zn(II)配合物;制備;抑菌性能

Abstract:Thiourea-chitosan-Zn(II)complex was prepared and characterized by FT-IR，UV-Vis absorbance spectra，XRD and TG-DTA methods.The antimicrobial activities of chitosan，thiourea-chitosan and thiourea-chitosan-Zn(II)complex against Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Aspergillus niger were investigated in vitro.The results showed that the antimicrobial activity of thiourea-chitosan-Zn(II)complex obviously enhanced compared to the chitosan and thiourea-chitosan，which can effectively inhibit the growth of Aspergillus niger.

Key words:Chitosan;Thiourea-chitosan-Zn(II)complex;Preparation;Antimicrobial activity

殼聚糖(Chitosan，簡稱CS)具有無毒、生物相溶、可降解、抑菌等特性，在醫(yī)學(xué)、食品營養(yǎng)學(xué)、環(huán)境保護、輕工業(yè)等領(lǐng)域有著極為廣泛的應(yīng)用。與一般抑菌劑相比，它具有抑菌活性高、廣譜、殺滅率高和無毒等優(yōu)點［1］。由于殼聚糖分子鏈中有大量羥基、氨基及N-乙酰氨基，這種特殊的結(jié)構(gòu)使殼聚糖通過氫鍵或鹽鍵形成具有類似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的籠形分子，從而對金屬和稀土離子有著穩(wěn)定的配位作用。硫脲化合物螯合金屬非常有效，廣泛應(yīng)用于金屬的提?。?］。殼聚糖新型衍生物硫脲殼聚糖對金屬離子亦有著穩(wěn)定的配位作用，并且金屬離子具有抗炎、殺菌、抗癌、抗凝血等藥理作用［2］，形成的配合物以期為高活性的抗菌劑。

對于硫脲殼聚糖與金屬離子配合物的研究不多。Chen等發(fā)現(xiàn)硫脲殼聚糖中的S原子和O原子參與了與Ag+的配位，且硫脲殼聚糖-Ag+具有很強的抑菌活性，最小抑菌濃度較殼聚糖降低20倍［4］。本實驗合成了硫脲殼聚糖(TUCS)，選擇了金屬離子Zn2+與 TUCS配位，采用 FT-IR、UV、DG-DTA 和XRD分析手段，并對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和真菌黑曲霉的抑菌性能進行了比較研究。該研究為CS及其衍生物的臨床應(yīng)用提供更加充分的實驗依據(jù)，并擴大了CS在醫(yī)藥和食品工業(yè)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

殼聚糖(浙江玉環(huán)殼聚糖有限公司，Mw=50 kDa，DD.90%)，用 1.0%(v/v)HAc 溶解。大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC 35218)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 26113)、黑曲霉(Aspergillus niger)均由天水市中醫(yī)院化驗科提供。

UV-9200型紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司);Spectrum One傅立葉紅外光譜儀(Perkin Elmere);Perkin Elmere TG-DTA分析儀(Pyris Diamond Analyzer)。

1.2 TUCS 的制備

將3.4 g的硫脲和3.0 g CS及30 mL的無水乙醇加入到三頸燒瓶中，溫度控制在65℃，回流攪拌12 h，產(chǎn)物冷卻至室溫，過濾、反復(fù)用乙醇洗滌，將過濾物溶解于100 mL的1%(v/v)乙酸溶液，加入10%(w/v)氫氧化鈉溶液進行過濾，收集沉淀，用水洗凈、干燥，得到 TUCS，產(chǎn)率為 85%［4］。

1.3 TUCS-Zn配合物的制備

在裝有0.5 g TUCS的錐形瓶中加入40 mL體積分數(shù)0.5%的乙酸溶液，在水浴振蕩器中振蕩1 h，待 TUCS 充分溶解后，加入0.1 g ZnCl2，用10%的HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，控溫反應(yīng)4 h后，加入200 mL丙酮溶液析出產(chǎn)物，充分洗滌并過濾，再用無水乙醇充分洗滌、過濾，真空干燥，得到白色產(chǎn)物，產(chǎn)率為67%。

1.4 TUCS-Zn配合物表征

采用KBr壓片，測定 CS、TUCS及 TUCS-Zn的紅外光譜;用1%(v/v)乙酸溶解配制1 mg/mL的CS、TUCS和TUCS-Zn溶液，于200～500 nm波長范圍內(nèi)測定紫外吸收光譜;以α-Al2O3為參比，升溫速率10 ℃ /min，對 CS、TUCS、TUCS-Zn 進行熱力學(xué)分析;采用XRD-6000粉末衍射儀，Kα射線，Zn靶，掃描范圍:0-40(2θ)，電壓40 kV，電流30 mA。

1.5 TUCS-Zn配合物抑菌活性及最低抑菌濃度的測定

抑菌圈法是將含有定量抗生素的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加抗生素的濃度呈對數(shù)減少，在藥物濃度到達的范圍內(nèi)對此藥敏感的細菌不能生長而形成透明的抑菌圈，以抑菌圈的直徑作為評定指標(biāo)，抑菌圈直徑越大，說明該抑菌劑對此種供試菌的抑制效果越好，反之則抑制效果越差。將E.coli和St.aureus接種于牛肉膏固體培養(yǎng)基，37℃活化24 h，制成菌懸液備用。取直徑6 mm已滅菌的圓濾紙片浸泡在濃度均分別為10、5、2.5 mg/mL的TUCS-Zn、TUCS和CS溶液中(1.0%乙酸溶解)。取0.1 mL菌懸液涂布在培養(yǎng)基平板上，爾后用無菌鑷子夾取浸泡過的圓濾紙片貼于培養(yǎng)皿中，每皿貼5片。以1.0%的HAc溶液作為空白對照。37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，測定抑菌圈直徑。

將真菌 A.niger接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，在27℃下活化72 h，用已滅菌的打孔器打直徑為0.8 cm 的菌片備用。CS、TUCS、TUCS-Zn與一定量PDA混合，使CS、TUCS及TUCS-Zn的最終濃度為 0.5、1.0、1.5 mg/mL，以等體積的 1.0%HAc溶液作為空白對照，三氯生為陽性對照，滅菌后倒平板，待冷卻后在培養(yǎng)皿中央貼一菌片，置于恒溫培養(yǎng)箱27℃培養(yǎng)，觀察A.niger菌絲體生長情況，直到對照組黑曲霉菌落幾乎長滿培養(yǎng)皿為止。

本實驗采用菌落平板記數(shù)法測定CS、TUCS、TUCS-Zn的最低抑菌濃度(MIC)。固體培養(yǎng)基和一定濃度的藥物混合，使藥物最終濃度分別為0、0.0625、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 和 1.5 mg/mL，滅菌倒平板，取0.1 mL稀釋至OD610=0.001的菌懸液涂布在培養(yǎng)基平板上，E.coli和St.aureus在37℃下恒溫培養(yǎng)，A.niger在27℃下恒溫培養(yǎng)，以肉眼觀察不到菌落對應(yīng)的濃度即為CS、TUCS、TUCS-Zn對 E.coli、St.aureus和 A.niger的 MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 TUCS-Zn配合物表征

2.1.1 紅外光譜

CS、TUCS和TUCS-Zn的紅外光譜如圖1所示。CS中位于3446 cm-1左右的N-H，O-H締合峰形，改性后發(fā)生位移且峰形變窄;CS原位于1664 cm-1處較強的酰胺吸收峰和1599 cm-1左右的-NH2面內(nèi)彎曲振動吸收峰，在TUCS中分別位移至1638 cm-1和1616 cm-1處，峰形變窄;且TUCS在1493 cm-1處出現(xiàn)一弱的新峰，表明在CS結(jié)構(gòu)中的-NH2引入硫脲基團［5］。與TUCS相比，TUCS-Zn的紅外光譜在848、916、950、990 cm-1出現(xiàn)新的吸收峰，歸屬為 S-Zn 伸縮振動峰。

圖1 CS、TUCS和TUCS-Zn的紅外光譜Fig.1 IR spectra of chitosan，thiourea chitosan and thiourea chitosan-Zn

2.1.2 紫外光譜

CS、硫脲、TUCS、TUCS-Zn的紫外光譜如圖2 所示。CS、TUCS、TUCS-Zn 分別在 224.50、235.00、234.00 nm有強吸收峰，這是由于配合物中氮、氧的孤對電子發(fā)生n→σ*躍遷和π→π*躍遷，導(dǎo)致電子光譜發(fā)生的變化所致，且在同一濃度下，TUCS-Zn的吸收強度高于CS和TUCS。表明配位作用發(fā)生。

2.1.3 差熱-熱重分析

CS、TUCS和 TUCS-Zn的 TG-DTA曲線如圖3所示。CS的降解分為兩個階段:第一個階段在80℃開始，失重10%，主要是失去水分子;第二個階段失重在250℃開始，到500℃失重達最大，失重55%，在230℃有一強的放熱峰，TG曲線上表現(xiàn)為一個顯著的失重變化;最終分解溫度688℃。TUCS熱分析表明，隨著失重的進行，差熱曲線出現(xiàn)多個放熱峰，是TUCS分解、氧化、燃燒的結(jié)果。在98.2℃～150℃之間有明顯失重并伴有2個低矮的放熱峰，失重達4.7%，當(dāng)溫度升至245℃左右有一強的放熱峰，峰形尖而高，與之相應(yīng)的熱重線又有明顯的失重拐點。這是由于TUCS減弱了殼聚糖分子的規(guī)整度和氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而降低了殼聚糖的結(jié)晶程度，導(dǎo)致分解溫度降低;對于TUCS-Zn，當(dāng)溫度升至217℃左右有一強的放熱峰，峰形尖而高，與之相應(yīng)的熱重線又有明顯的失重拐點?？赡苁怯捎赥UCS與Zn2+配位后，其分子內(nèi)的氫鍵結(jié)合被破壞，結(jié)晶度發(fā)生改變，熱穩(wěn)定性減小。這種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變化表明，TUCS與金屬離子配合后，分子中不同金屬離子與含有孤對電子的活性基團-NH2、-OH的配合作用，不僅改變了聚合物的部分化學(xué)鍵性質(zhì)及其原子之間的相互作用，必然要改變它們的穩(wěn)定的空間構(gòu)象［6］，進而此次級轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)變溫度略有降低，它們的不穩(wěn)定性是由于缺少自由的氨基，在制備衍生物時氨基被取代，而CS因其有自由的氨基而更穩(wěn)定。

圖2 CS、硫脲、TUCS、TUCS-Zn 的紫外光譜(1-硫脲，2-CS，3-TUCS，4-TUCS-Zn)Fig.2 UV spectrum of chitosan，thiourea，thiourea chitosan，thiourea chitosan Zn(II)

圖3 CS、TUCS和TUCS-Zn的TG-DTA 曲線Fig.1 TG-DTA curves of chitosans(A)，thiourea chitosan(B)，and thiourea chitosan-Zn(II)complexes(C)

2.1.4 X-射線衍射

圖4 為CS、TUCS和TUCS-Zn的X衍射譜圖。CS 在2θ 為10.4°和19.8°處出現(xiàn) 2 個特征衍射峰，呈現(xiàn)“L-2 polymorph”晶型衍射圖。TUCS在這兩處的衍射峰強度顯著減弱，是由于TUCS減弱了CS分子的規(guī)整度和氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而降低了CS的結(jié)晶程度。TUCS-Zn在10.4°和 19.8°處的衍射峰幾乎消失，出現(xiàn)新的衍射峰，表明有規(guī)則的結(jié)晶相形成［7］。采用elementar Vario EL元素分析儀測得C%(38.1)，H%(6.42)，N%(8.42)，S%(0.4)，WF-110B原子吸收光譜儀測得Zn(Ⅱ)%(9.85)。

圖4 CS(a)、TUCS(b)和TUCS-Zn(c)的X衍射譜圖Fig.4 XRD of chitosans(a)，thiourea chitosan(b)，and thiourea chitosan-Zn(II)complexes(c).

2.2 抑菌實驗

抑菌圈直徑越大，說明該抑菌劑對此種供試菌的抑制效果越好，反之則抑制效果越差。不同濃度CS、TUCS 和 TUCS-Zn對 E.coli和 St.aureus對應(yīng)的抑菌圈直徑如表1所示?？梢钥闯?，CS、TUCS和TUCS-Zn作用 E.coli和 St.aureus后，均具有明顯的抑菌圈，且隨著樣品濃度的增加，與對照組相比抑菌圈的直徑逐漸增加;TUCS-Zn的抑菌圈直徑比單一的CS、TUCS顯著增大，說明 TUCS-Zn對 E.coli和St.aureus的生長有較好的抑制作用。TUCS和金屬鋅離子配位后，雖然一定程度上破壞了結(jié)構(gòu)中的-NH2的陽離子化，使消毒因子-NH3+減少，但分子表面正電荷密度增加，從而增強了聚陽離子吸附到帶負電荷的細菌表面的能力，并且Zn2+具有較多的核外電子和較小的離子半徑，與TUCS結(jié)合作用很強，具有高電子密度的TUCS-Zn配合物更容易和細菌表面作用進而顯示更強的抑菌效果。且Zn2+也具很強的抑菌性能，故TUCS-Zn配合物的抑菌性能較CS、TUCS遠遠增強。

表1 CS、TUCS和TUCS-Zn對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈Table 1 Bacteriostasis-diameter of CS，TUCS and TUCS-Zn(II)against E.coli and St.aureus

TUCS-Zn配合物對黑曲霉生長的影響如表2所示。當(dāng)黑曲霉培養(yǎng)第4 d時，對照組黑曲霉菌落的徑向生長十分旺盛，菌落覆蓋了整個培養(yǎng)皿，有大量呈炭黑色的孢子生長繁殖。在培養(yǎng)基中加入殼聚糖、TUCS和TUCS-Zn后，黑曲霉菌落的徑向生長均比對照組小，其中培養(yǎng)基中加入TUCS-Zn后黑曲霉菌落的徑向生長最小，且隨著TUCS-Zn濃度的增大，菌絲體直徑逐漸減小。數(shù)據(jù)表明CS、TUCS和TUCS-Zn對黑曲霉生長均有抑制作用，且TUCS-Zn的抑制作用最強。

表2 CS、TUCS和TUCS-Zn(II)對黑曲霉生長的影響Table 2 Effect of CS，TUCS and TUCS-Zn(II)on the growth of A.niger

由表3可以看出，改性后的TUCS和TUCS-Zn對三種被試菌的最小抑菌濃度都比殼聚糖小，進一步說明TUCS-Zn配合物具有更好的抑菌性能。

表3 CS、TUCS 和 TUCS-Zn(II) 對 E.coli、St.aureus和 A.niger的最小抑菌濃度Table 3 MIC of CS、TUCS and TUCS-Zn(II)against E.coli，St.aureus and A.niger

3 結(jié)論

利用FT-IR、UV、TG-DTA和XRD手段，對合成的TUCS及TUCS-Zn(II)配合物進行了表征。抑菌實驗結(jié)果表明，TUCS-Zn配合物對細菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能比單一的CS、TUCS顯著提高，對真菌黑曲霉亦具有較強的抑制作用。

1 Kim CH，Kim SY，Choi KS.Synthesis and antibacterial activity of water-soluble chitin derivatives.Polym Advan Technol，1997，8:319-325.

2 Aibin M，Cader BM，Horrocks Jr W.et al.Lanthanide complexes of ionophore-Spectroscopic characterization of lanthanide(Ⅲ)ion binding to lasalocid A and A23187 in methanol.Inorg Chem，1984，23:3045-3050.

3 Chanda M，Rempel GL.Polybenzimidazole resin based new chelating agents.Palladium(Ⅱ)and platinum(Ⅳ)sorption on resin with immobilized dithiooxamide.React Polym，1990，12，83-94.

4 Chen SP，Wu GZ，Zeng HY.Preparation of high antimicrobial activity thiourea chitosan-Ag+complex.Carbohydr Polym，2005，60:33-38

5 Padhye S.Transition metal complexes of semicarbazones and thiosemicarbazones.Coord Chem Rev，1985，63，127-135.

6 Lin F(林芳)，Jia XG(賈新剛)，Qin L(秦磊)，et al.Adsorption conditions optimization of Cu(Ⅱ)to chitosan.China Leather(中國皮革).2008，3(37):29-33.

7 Muzzarelli RAA，F(xiàn)errero A，Pizzoli M.Light-scattering，X-ray diffraction，elemental analysis and infrared spectro-photometry characterization of chitosan，a chelating polymer，Talanta，1972，19:1222-1226.

Preparation，Characterization and Antimicrobial Activity of Thiourea-chitosan-Zn(II)Complex

FENG Xiao-qiang*，LI Xiao-fang，YANG Sheng，ZHANG Jing-feng
College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001

O627181

A

1001-6880(2012)08-1075-05

2010-07-28 接受日期:2012-06-02

甘肅天水師范學(xué)院物理無機化學(xué)重點學(xué)科基金資助項目(ZD0840)

*通訊作者 Tel:86-015337018100;E-mail:fengxiaoqiang1979@163.com