紅托竹蓀多糖抗氧化活性的研究

王蓓蓓，段玉峰，邵紅軍，田 甜，牛付閣，梁 蕾

陜西師范大學食品工程與營養科學學院，西安710062

紅托竹蓀(Dictyophora rubrovalvata)是1976年發表的新種，是由我國學者命名的。它是一種擔子菌(Eumycota)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、腹菌綱(Gasteromycetes)、鬼筆目(Phallales)、鬼筆科(Phallaceae)、竹蓀屬(Dictyophora)，野生紅托竹蓀主要分布于中國貴州中(西)部、云南、四川和浙江等省區竹林下的腐殖土上。紅托竹蓀較高的營養價值，此外還含有極為豐富的礦物元素［1，2］。除其營養價值外，同時還具有一定的防病保健作用，長期服用竹蓀具有治療慢性氣管炎、降低血壓和減少血液中的膽固醇含量等功能。紅托竹蓀是竹蓀中的珍品，具有很大的開發優勢。多糖是紅托竹蓀子實體中重要組成成分之一。關于竹蓀生物活性成分的研究最早見于日本人對長裙竹蓀多糖抗腫瘤的研究，表明其具有抗腫瘤，提高免疫力的功能［3］。目前，對紅托竹蓀的研究主要集中于栽培條件［4］、多糖的提取工藝及其抗腫瘤［3］的研究。國內外對紅托竹蓀多糖的體外抗氧化活性研究較少［3，5］。

鑒于此，本論文主要以貴州織金縣紅托竹蓀為研究對象，對其中多糖的抗氧化活性進行研究，從而為進一步開發利用紅托竹蓀提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紅托竹蓀購于貴州織金縣，由中國科學院昆明植物研究所副研究員于富強鑒定為紅托竹蓀(D.rubrovalvata)乙醇(75%)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、FeSO4·7H2O、DPPH自由基、H2O2、抗壞血酸(VC)、二丁基羥基甲苯(BHT，食品級); RE-52AA型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠); SHZ-III型循環真空泵(上海亞榮生化儀器廠); AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);HHW-21CU-600型電熱恒溫水槽(上海福瑪實驗設備有限公司);DGX-9073B-1電熱鼓風干燥箱(上海福瑪實驗設備有限公司);Alphal-4型真空冷凍干燥機(德國Chris公司);WFJ2000型可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司);T6新世紀紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);800B型離心機(上海安亭科學儀器廠)

2 方法

2.1 紅托竹蓀多糖粗提物的制備

稱取烘干的紅托竹蓀15 g，過40目篩，用75%乙醇脫脂48 h，揮干乙醇，然后以水為提取溶劑，料液比1∶31，提取溫度75℃，提取3.5 h，對提取液進行離心(3000 rpm)20 min，取上清液。將得到的粗提液減壓濃縮至膏狀，用少量蒸餾水溶解所得到的濃縮物，直至無色。然后將得到的濃縮物真空冷凍干燥24 h，得到竹蓀多糖粗提物，備用。

總糖含量測定采用苯酚-硫酸法［6］。繪制標準曲線:準確稱取標準葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，蒸餾水定容。精確稱取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mL，分別加入試管中，補水至2.0 mL，加入6%苯酚1.0 mL和濃硫酸5 mL，放置10 min后，搖勻，室溫放置20 min，于490 nm處測定吸光度值，平均測定三次，取平均值，以2.0 mL蒸餾水同樣操作作為空白，以葡萄糖濃度作為橫坐標，吸光度值作為縱坐標，得葡萄糖標準曲線回歸方程。

樣品的測定，取一定濃度的樣品溶液1.0 mL，補水至2.0 mL，其他操作同上，測定吸光度值，根據標準曲線計算多糖含量。

2.3 紅托竹蓀多糖總還原能力的測定

一般情況下，樣品的還原能力與抗氧化活性之間有顯著的相關性。樣品反應后的生成物在700 nm處的吸光度的大小即反映了其抗氧化能力的大小，吸光度值越大，則樣品的還原能力越強，紅托竹蓀多糖的還原力測定依照文獻進行［7］。于1 mL不同濃度的紅托竹蓀多糖溶液中加入2.5 mL，0.2 mol/L，pH為6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL，1%的鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20 min，加入2.5 mL，10%的三氯乙酸(TCA)溶液，3000 rpm離心10 min，取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL蒸餾水0.5 mL FeCl3(0.1%)，于700 nm處測定吸光值。以VC和BHT為對照，每組做3個重復，求其平均值。

2.4 紅托竹蓀多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法［8］，取pH為8.12的Tris-HCl緩沖液6.0 mL和蒸餾水0.5 mL，混勻，37℃水浴10 min，加入37℃預熱過的7 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液(PR)1 mL，迅速搖勻，混勻后精確反應4 min，用0.5 mL濃鹽酸終止反應，測325 nm處吸光度值A0。取pH為8.12的Tris-HCl緩沖液6 mL，分別加入不同質量濃度的竹蓀多糖溶液0.5 mL，37℃水浴10 min，最后加入37℃預熱過的7 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液(PR)1 mL，迅速搖勻，混勻后精確反應4 min，用0.5 mL濃鹽酸終止反應，測325 nm處吸光度值A。以VC和BHT作為陽性對照，每組做3個重復，求其平均值。

計算公式如下:

2013年，水利系統迎難而上，在成功應對東北流域性大水、南方大范圍干旱、沿海超強臺風等方面做了大量工作，水利事業取得新進展，有力支撐了糧食“十連增”和經濟社會發展。謹向全國廣大水利干部職工表示誠摯問候！希望同志們認真落實黨中央、國務院決策部署，圍繞改革創新、轉型升級和民生改善，集中力量建設一批重大關鍵性水利工程，夯實農田水利基礎，增強防災抗災能力，嚴格水資源管理，為全面建成小康社會提供堅實的水安全保障。

2.5 紅托竹蓀多糖對羥基自由基的清除作用［9，10］

利用Smironff等的改進方法，在10 mL的試管中依次加6 mmol/L FeSO42 mL、2 mL不同濃度的竹蓀多糖溶液或VC溶液、BHT溶液，以及6 mmol/L的 H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置 10 min，再加入6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，搖勻，靜置30 min后，于510 nm處測定吸光值，以VC和BHT作為陽性對照，每組做3個重復，求其平均值。按以下公式計算各試樣對羥基自由基(OH·)的清除率:

清除率(%)=A0-(AS-AX)/A0×100%

式中:A0—不加樣品溶液的吸光值;AS—加入樣品溶液反應后的吸光值;AX—不加水楊酸溶液時紅托竹蓀多糖的吸光值;

2.6 紅托竹蓀多糖對DPPH自由基的清除作用［7］

將紅托竹蓀多糖、VC和BHT分別配成等濃度(0.2～1.2 mg/mL)的溶液，吸取0.5 mL試樣與0.5 mL水于試管中，混合均勻后，再加入DPPH·溶液充分搖勻，在室溫下避光保存20 min，然后在517 nm處測定吸光值，并以VC和BHT作陽性對照，以95%乙醇調零，每個處理試樣均做三個平行實驗，按下式計算各試樣對DPPH·自由基的清除率:

式中:A0—0.5 mL95%乙醇+0.5 mL水+2 mL DPPH·的吸光值;AS—0.5 mL試樣+0.5 mL水+2 mL DPPH·的吸光值;AX—0.5 mL試樣+ 0.5 mL水+2 mL95%乙醇的吸光值;

2.7 半數清除率(EC50)的測定

EC50指清除率為50%時所需樣品的質量濃度。所需質量濃度越低，表明半清除率越高，清除效果越好［11］。將各項實測數據用擬合優化法來模擬S曲線，可通過Scatchard法和Hill法使量效關系S型曲線直線化［12］，并得出線性方程y=mx+c，從中即可計算出EC50值。

3 結果與分析

3.1 總糖含量

所測得結果做標準曲線:y=0.1061x+0.1566(R2=0.9902)，以葡萄糖濃度作為橫坐標，吸光度值作為縱坐標。計算出提取物中總糖含量為80.9%.

3.2 總還原能力的測定

圖1 紅托竹蓀多糖總還原能力的測定Fig.1 Reducing capacity of polysaccharides from D.rubrovalvata

由圖4所示，紅托竹蓀多糖具有一定的還原能力，隨著多糖質量濃度的增大，總還原能力隨之增強。在所測定的濃度范圍內，紅托竹蓀多糖的還原能力稍低于BHT的，但明顯低于VC的。

3.3 對超氧陰離子自由基的清除作用

圖2 紅托竹蓀多糖對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.2 Scavenging activities on O of polysaccharides from D.rubrovalvata

由圖1所示，在樣品濃度低于0.4 mg/mL時，紅托竹蓀多糖對超氧陰離子自由基的清除作用很小，但隨著質量濃度的增大，清除率逐漸增大，最大可達到20%。當質量濃度大于0.6 mg/mL時，多糖的清除效果大于BHT的，但都小于VC的。

3.4 對羥基自由基的清除作用

由圖2所示，紅托竹蓀多糖對OH·的有一定的清除作用，其清除率最大可達到59%，在所測定的濃度范圍內，紅托竹蓀多糖對OH·的清除效果明顯大于BHT的46.7%，但都明顯小于VC的。

圖3 紅托竹蓀多糖對羥基自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activities on OH· of polysaccharides from D.rubrovalvata

3.5 對DPPH自由基的清除作用［13］

圖4 紅托竹蓀多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.4 Scavenging activities on DPPH· of polysaccharides from D.rubrovalvata

由圖3所示，在實驗所測的濃度范圍內，紅托竹蓀多糖對DPPH自由基有一定的清除效果，并隨著樣品質量濃度的增大，清除率逐漸增大，呈現一定的量效關系。并且紅托竹蓀多糖對DPPH自由基的清除效果大于BHT的，但小于VC的。

3.6 半數清除質量濃度(EC50)測定結果［14］

表1 多糖、BHT和VC的EC50值Table 1 The value of EC50on polysaccharides，BHT and VC

EC50值越低，表明清除率越高，清除效果越好。由表1可知，紅托竹蓀多糖清除O和DPPH·的EC50值明顯小于BHT的，表明紅托竹蓀多糖有一定的抗氧化能力。

4 結論

本實驗采用體外產生的活性自由基系統，通過測定樣品中總多糖對自由基的清除作用，從而對紅托竹蓀的抗氧化能力進行研究。在所測定的濃度范圍內，紅托竹蓀多糖對O-·2、OH·均有一定的清除作用，其清除效果與BHT的基本相當，但都明顯低于VC的清除能力;對DPPH自由基有一定的清除作用，且略高于BHT的清除作用，但都低于VC。總體而言，紅托竹蓀多糖具有一定的抗氧化能力，為進一步的開發利用提供了理論依據。

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