雷米普利對(duì)急性血瘀模型大鼠血小板功能的影響

孟繁宇，施 慧

（1．吉林省人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130021；2．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院）

目前，雷米普利的臨床適應(yīng)癥僅限于原發(fā)性高血壓及急性心肌梗死后出現(xiàn)的輕－中度心力衰竭。雷米普利是否具有抑制血小板功能尚未見報(bào)道。本文旨在通過研究不同劑量組急性血瘀模型大鼠的血小板粘附、聚集功能評(píng)價(jià)雷米普利在活血化瘀方面的作用，為擴(kuò)大其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雌雄兼用，體重210～240g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給，合格證號(hào)：SCXK（吉）2003－0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于動(dòng)物室內(nèi)，室溫（20±2）℃，自由進(jìn)食與飲水。

1．2 藥品與試劑

1．2．1 雷米普利（Ramipril）片 意大利 Aventis Pharma S．p．A生產(chǎn)，北京安萬特制藥有限公司包裝，批號(hào)：20080815，以0．5%羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度。

1．2．2 血栓素B2（TXB2）及6－酮－前列腺素Fla（6－Keto－PGFla）試劑盒由北京美迪科生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)：20080825。

1．2．3 0．1%鹽酸腎上腺素注射液，北京永康制藥廠出品，批號(hào)：20081030。

1．3 主要儀器

1．3．1 LBY－NJ2型血小板聚集儀 北京普利生醫(yī)療器械廠。

1．3．2 LBY－F5血小板黏附儀 北京普利生醫(yī)療器械廠。

1．4 實(shí)驗(yàn)方法

1．4．1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 健康Wistar大鼠50只，隨機(jī)均分為5組，分組如下：①正常對(duì)照組：灌胃0．5%羧甲基纖維素鈉5ml／kg；②急性血瘀模型組：灌胃0．5%羧甲基纖維素鈉5ml／kg；③雷米普利小劑量組：灌胃 Ramipril 0．5mg／kg；④雷米普利中劑量組：灌胃 Ramipril 1mg／kg；⑤雷米普利大劑量組：灌胃Ramipril 2mg／kg；藥物組每天灌胃給藥1次，連續(xù)6d，正常對(duì)照組及急性血瘀模型組給予等體積0．5%羧甲基纖維素鈉。

1．4．2 大鼠急性血瘀模型的建立 第6d給藥30 min，除正常對(duì)照組大鼠外，其它各組大鼠均皮下注射0．1%腎上腺素0．8ml／kg，2h后將大鼠浸入冰水中5min，2h后再按0．6mL／kg注射一次0．1%腎上腺素以復(fù)制急性血瘀模型［1，2］。大鼠復(fù)制急性血瘀模型后禁食不禁水（包括正常對(duì)照組大鼠）12h。

1．4．3 觀測(cè)指標(biāo) 第7d給藥后1h，每組動(dòng)物以戊巴比妥鈉30mg／kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，肝素抗凝，從加有抗凝劑的3ml全血以3 000r／min離心10min，取上層血漿用放免法測(cè)定血漿6－Keto－PGFla（代表PGI2）及TXB2（代表TXA2）；腹主動(dòng)脈取血1ml，用3．8%的枸櫞酸鈉按1：9比例抗凝，1 000r／min離心10min，取20μl血漿加入到380μl血小板稀釋液中，混勻，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，靜置10min，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)血小板數(shù)。剩余血加入LBY－5F血小板黏附儀的球形玻璃瓶中按3．7r／min旋轉(zhuǎn)15min，取黏附后血漿20μl滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在光鏡下計(jì)數(shù)黏附后的血小板數(shù)，計(jì)算血小板黏附率（PA）【PA＝（黏附前血小板數(shù)－黏附后血小板數(shù)）／黏附前血小板數(shù)×100%】；腹主動(dòng)脈取血1．5ml，用3．8%的枸櫞酸鈉按1：9比例抗凝，混勻，1 500r／min離心5min，所得上清為富血小板血漿（PRP），吸取200μl PRP注入放有攪拌子的比色杯中，置于后方的恒溫孔中備用。余下抗凝血以3 000r／min離心10min，所得上清為貧血小板血漿（PPP）。吸取第二次離心的上清液PPP 200μl注入比色杯中，置于檢測(cè)孔，自動(dòng)檢測(cè)零點(diǎn)后取出PPP杯，插入PRP杯，用微量進(jìn)樣器吸取配制好的血小板聚集劑二磷酸腺苷（ADP）11μl沿比色杯一角插入底部，迅速推入被測(cè)樣品中，以LBY－NJ2型血小板聚集儀按比濁法測(cè)定血小板聚集活性，求出1、3、5min的血小板聚集率（PAG）及最大血小板聚集率（MPAG）。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS11．0軟件，均以ˉx±s表示，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 雷米普利對(duì)急性血瘀模型大鼠血小板黏附和聚集功能的影響

與正常對(duì)照組比較，急性血瘀模型組大鼠的血小板黏附率，1、3、5min血小板聚集率及最大血小板聚集率均明顯增高（P＜0．05或P＜0．01）。與急性血瘀模型組比較，雷米普利1、2mg／kg組均可使血小板黏附率及1、3、5min血小板聚集率和最大血小板聚集率明顯降低（P＜0．05或P＜0．01），見表1、2。

表1 雷米普利對(duì)急性血瘀模型大鼠血小板黏附活性的影響

表2 雷米普利對(duì)急性血瘀模型大鼠血小板聚集活性的影響

2．2 雷米普利對(duì)急性血瘀模型大鼠血漿PGI2及TXA2水平的影響

與正常對(duì)照組比較，急性血瘀模型組血漿TXA2含量明顯增加，PGI2含量及PGI2／TXA2比值明顯降低（P＜0．05或P＜0．01）。與急性血瘀模型組比較，雷米普利1、2mg／kg組均可使血漿TXA2含量明顯降低，PGI2含量及PGI2／TXA2比值明顯增高（P＜0．05或P＜0．01）；雷米普利0．5 mg／kg可使血漿PGI2含量及PGI2／TXA2比值明顯增高（P＜0．05），對(duì)血漿TXA2含量無明顯影響（P＞0．05），見表3。

表3 雷米普利對(duì)急性血瘀模型大鼠血漿PGI2及TXA2水平的影響

3 討論

研究表明，急性心梗患者由于冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的破裂血管內(nèi)皮受損，釋放組織因子、膠原纖維暴露，活化血小板，使血小板黏附、聚集功能明顯增強(qiáng)。同時(shí)活化的血小板對(duì)血液中的各種炎性因子的反應(yīng)能力增強(qiáng)，進(jìn)一步加速了黏附與聚集，大大加速血栓的形成。當(dāng)急性心梗時(shí)血管內(nèi)皮受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，內(nèi)皮功能紊亂，導(dǎo)致內(nèi)源性舒張因子：PGI2、NO、ADP酶等生成減少，對(duì)局部抑制血小板粘附、聚集的作用減弱，使得局部血小板易活化及聚集，功能亢進(jìn)，而其釋放的TXA2等活化物質(zhì)使病人血管和側(cè)支循環(huán)收縮，引起冠脈痙攣。活化的血小板釋放出：Ca2＋、ADP、TXA2，通過正反饋機(jī)制促進(jìn)血小板的黏附與聚集，形成小血栓阻塞小動(dòng)脈，導(dǎo)致心肌梗死。血栓形成過程消耗了大量的血小板，血小板數(shù)目的減少反映了血小板在梗死部位的消耗，由此可見血小板直接參與了心肌梗死的病理過程，血小板的功能狀態(tài)是急性冠脈綜合征病情進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸的重要指標(biāo)［3］。現(xiàn)已知，前列環(huán)素（PGI2）和一氧化氮（NO）是對(duì)血小板激活最具特異性的兩種內(nèi)皮源性抑制劑，最具特異性的激活劑為血栓素A2（TXA2）。上述環(huán)節(jié)和因子相互協(xié)調(diào)以調(diào)節(jié)血小板的功能，在血栓性疾病的形成中起重要作用。TXA2（血栓素A2）：是前列腺素G2和H2在血小板內(nèi)血栓烷合成酶催化下生成的。因TXA2的不穩(wěn)定性，以目前的技術(shù)水平難以直接測(cè)定TXA2，故國(guó)內(nèi)外均以測(cè)定TXB2作為判斷其濃度的指標(biāo)［4］。TXA2以自分泌和旁分泌的形式作用于脈管系統(tǒng)，具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，包括使血小板脫顆粒，促進(jìn)血小板聚集，促進(jìn)凝血和血栓形成［5］。同時(shí)TXA2還能引起血管收縮，使血管平滑肌細(xì)胞增殖肥大，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。TXA2也能夠通過正反饋進(jìn)一步刺激血小板的活化［6］。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞中含有前列環(huán)素合成酶，可利用自身的花生四烯酸合成PGI2（前列環(huán)素），PGI2具有抗凝血、舒張血管和抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用。PGI2抑制血小板聚集的濃度大大低于抑制血小板黏附的濃度，既PGI2不但允許血小板參與血管輕微損傷的修復(fù)，而且同時(shí)又防止血栓形成。血小板釋放ADP、ATP、鈣離子及5－羥色胺等物質(zhì)，也能促進(jìn)PGI2合成。但當(dāng)機(jī)體受到機(jī)械損傷、血流紊亂等理化因素影響時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出內(nèi)皮下層組織，會(huì)引起血小板的活化，發(fā)生釋放反應(yīng)，隨著血小板的激活，產(chǎn)生的TXA2增加，使PGI2／TXA2平衡失調(diào)，從而加速血栓形成［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷米普利可明顯降低血小板粘附及聚集功能，降低血漿TXA2水平，并明顯升高PGI2水平及PGI2／TXA2比值，提示其可能通過糾正PGI2與TXA2之間的平衡失調(diào)發(fā)揮抗血小板粘附和聚集作用，這對(duì)于預(yù)防冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成具有益處。

［1］毛騰敏，林建和．“血瘀”病理模型探索（一）［J］．北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1985，17（4）：246．

［2］毛騰敏．以活血化瘀藥的預(yù)防性治療檢測(cè)大白鼠急性“血瘀”模型［J］．北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1987，19（4）：234．

［3］王愛林，任 刃，吳華民，等．冠心病患者循環(huán)血液中活體血小板形態(tài)改變［J］．中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，1995，15（4）：8．

［4］Yamanaka S，Mium K，Yu kimum T，et al．11－Dehydro thromboxane B2：a reliable parameter of thromboxane A2production in dogs［J］．Prostaglandins，1993，45（3）：221．

［5］Masuda A，Mais DE，Oatis JE，et al．Platelet and vascular thromboxane A2／prostaglandin H2receptors［J］．Biochem Pharmacol．1991，42：537．

［6］Ali A，Davis MG，Becker MW，et al．Thromboxane A2stimulates vascular smooth muscle hypertrophy by upregulating the synthesis and release of endogenous basic fibroblast growth factor［J］．J Biol Chem，1993，268：17397．

［7］Vesterqvist O．Measurements of the in vivo synthesis of thromboxane and prostacyclin in humans［J］．Scand J Clin Lab Invest，1988，48（5）：401．