鎂離子濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長動力學的影響

劉欣偉，馮雅麗，李浩然，蔡震雷，楊志超

(1. 北京科技大學 土木與環境工程學院, 北京 100083；2. 中國科學院 過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190)

鎂離子濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長動力學的影響

劉欣偉1，馮雅麗1，李浩然2，蔡震雷1，楊志超1

(1. 北京科技大學 土木與環境工程學院, 北京 100083；2. 中國科學院 過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190)

在氧化亞鐵硫桿菌(T. f)培養過程中其他營養物質足量的情況下，通過考察不同初始Mg2+濃度對氧化亞鐵硫桿菌(T. f)生長活性的影響，得到在不同Mg2+濃度下細菌的生長曲線。結果表明：T. f對Mg2+具有一定的耐受能力；當培養基中ρ(Mg2+)≤10 g/L時，Mg2+對細菌生長活性影響很小；其ρ(Mg2+)為15 g/L時，Mg2+開始產生延遲效應，抑制細菌生長；ρ(Mg2+)為20 g/L時，細菌生長完全受到抑制。同時利用基于存在非競爭性抑制的Monod方程，建立了T. f在高Mg2+濃度下的生長動力學方程模型，確定在不同條件下細菌生長動力學參數，包括最大比生長速率μmax、Monod常數Km及鎂離子抑制常數KI。利用correl系數工具分析細菌比生長速率的實驗值和模擬值之間的相關系數為 0.973，表明該動力學方程能較好地描述Mg2+濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長的影響。

氧化亞鐵硫桿菌；生長動力學；非競爭性抑制；比生長速率

Abstract:When the other nutrients were sufficient in the culture ofThiobacillus ferrooxidans, the impact of the different initial Mg2+concentration on the activity of the growth ofThiobacillus ferrooxidanswas studied, and the bacterial growth curves were obtained at different magnesium ion concentrations. The results of the experiment show thatThiobacillus ferrooxidansis tolerant to Mg2+some extent. No bad effect on the growth and activity ofThiobacillus ferrooxidansby Mg2+is brought when cultured in 9K medium containingρ(Mg2+)≤10 g/L. The growth and activity ofThiobacillus ferrooxidansare obviously influenced by Mg2+whenρ(Mg2+) is 15 g/L. When the concentration of Mg2+is around 20 g/L,the growth and activity ofThiobacillus ferrooxidansare completely inhibited. Simultaneously the kinetic model for the growth ofThiobacillus ferrooxidansat high magnesium ion concentrations is deduced on the basis of the non-competitive inhibition of the Monod equation. The values of kinetic parameters (i.e. maximum growth rateμmax, Monod constantKmand magnesium ion inhibition constantKI) under different initial experiment conditions are determined. The correlation coefficient between the simulated and experiment specific growth rates is 0.973, which shows that the kinetics equation can well describe the effect of magnesium ion concentration on the growth ofThiobacillus ferrooxidans.

Key words:Thiobacillus ferrooxidans; growth kinetics; non-competitive inhibition; specific growth rate

隨著高品位鎳礦資源的減少, 低品位鎳礦資源目前進入開發回收階段[1]。從低品位礦中回收鎳是我國保證鎳資源供應的基礎保證[2?3]。我國金川公司(JNMC)擁有約400 Mt低品位硫化鎳礦，平均鎳品位為 0.60%，是典型的高鎂型低品位硫化鎳礦。由于高昂的成本和日趨嚴緊的環保要求，采用處理富礦的生產工藝處理這些貧礦是不可行的。本文作者針對金川高鎂型低品位硫化鎳礦的氧化亞鐵硫桿菌(T. f)浸出工藝進行研究，由于該礦的主要脈石礦物為含鎂高的蛇紋石及綠泥石，在細菌浸出過程中部分Mg2+進入溶液中。Mg2+對于細菌生長是必需的，但是當Mg2+超過細菌生長耐受范圍時，過高的滲透壓會導致細菌死亡。Mg2+對T. f生長活性的影響，國內外已有文獻報道[4?6]，但從動力學[7?10]方面考察Mg2+濃度對T. f生長動力學的影響尚未見文獻報道。

在此，本文作者旨在通過監測高Mg2+濃度培養條件下的T. f菌生長過程，利用存在非競爭性抑制的Monod模型[11]，得到高鎂濃度培養條件下的T. f菌生長動力學方程，以期對利用T. f浸出高鎂型低品位硫化鎳礦的生產實踐起到一定的指導作用。

1 實驗

1.1 培養條件

實驗用菌種氧化亞鐵硫桿菌(T. f)，實驗室保藏。在高鎂離子濃度下經馴化后，用于實驗。

培養基為9K培養基，Mg2+采用MgSO4·7H2O(化學純)配置，培養溫度為30～32 ℃，培養時間為120 h，接種濃度為1×107/mL，接種量為10%，顯微鏡記數。

培養方式如下：在250 mL錐形瓶中裝入按上述條件配置的100 mL培養液，置于SZX?B型恒溫水浴振蕩搖床內，用DZS?707型多參數分析儀測定溶液氧化還原電位(φ)，定期補加蒸餾水彌補損耗的水分。

1.2 不同 Mg2+濃度下氧化亞鐵硫桿菌生長曲線的測定

測定細菌的生長曲線對掌握高鎂離子濃度下細菌生長規律很重要。實驗將轉代培養后的細菌分別接入初始ρ(Mg2+)=0.004 9～20 g/L、初始pH=1.8的培養基中，菌種濃度為1×107/mL，接種量為10%。定期測定培養基中的細菌數、亞鐵離子濃度ρ(Fe2+)及三價鐵離子濃度ρ(Fe3+)。

1.3 主要儀器及分析方法

主要儀器如下：722型光柵分光光度計；pHS?29A型酸度計；DZS?707型多參數分析儀；SZX?B型恒溫水浴振蕩搖床；XS?18電子顯微鏡。

分析方法如下：Fe2+和總鐵分析采用鄰菲啰啉分光光度法測定，Fe3+的量由總鐵和Fe2+的量之差確定；細菌活體數采用血球計數法測定；溶液的氧化還原電位用DZS?707型多參數分析儀測定。

1.4 生長動力學模型

綜合氧化亞鐵硫桿菌的生長動力學模型，本文作者選擇一種存在非競爭性抑制的 Monod方程[11]。該方程表達形式簡單，有利于工業應用，其公式如下：

2 實驗結果與討論

2.1 氧化亞鐵硫桿菌生長過程中代謝變化

通過改變培養基中Mg2+濃度(0.004 9 g/L(基礎培養基)，5，10，15和20 g/L)，對T. f菌生長過程的代謝變化進行研究，得到細胞濃度，亞鐵濃度ρ(Fe2+)及三價鐵濃度ρ(Fe3+)隨時間的變化曲線如圖1所示。

研究結果表明，適當增加培養基中Mg2+含量有利于細菌生長；當ρ(Mg2+)≤10 g/L時，Mg2+對細菌生長活性影響很小，不影響細菌的生長繁殖；但當溶液中Mg2+濃度升至15 g/L時，開始產生延遲效應，抑制細菌生長；當溶液中Mg2+濃度升至20 g/L時，細菌的生長繁殖完全停止，菌體開始死亡。MgSO4是細菌培養基的主要成分，它對細菌細胞的結構如核糖體、細胞膜等的穩定性起重要作用。但隨著 Mg2+質量濃度的升高，體系的滲透壓增大，會影響細菌正常的生理功能。細菌調節體內Mg2+濃度的能力是有限的，因此，Mg2+濃度過高會造成細菌生長停滯甚至死亡。在已有文獻所得T. f菌的生長動力學方程中，普遍認同金屬離子對T. f菌生長的非競爭性抑制[12?13]，在本實驗中以此為基礎建立動力學方程。

2.2 不同Mg2+濃度對溶液氧化還原電位(φ)的影響

試驗在Mg2+濃度為0.004 9～20 g/L范圍內考察了溶液氧化還原電位φ的變化情況，結果如圖2所示。

細菌生長過程中，溶液中主要發生的反應如下：

根據能斯特方程和反應式中各物質的熱力學數據，計算溶液中的氧化還原電位如式(4)

式(4)表明隨著T. f菌將溶液中的Fe2+氧化為Fe3+，Fe3+濃度增加，ρ(Fe3+)/ρ(Fe2+)比值增加，導致溶液氧化還原電位φ上升。由圖2可知，當ρ(Mg2+)≤10 g/L時，溶液中最大氧化還原電位φ基本不變，為610 mV，表明細菌活性受 Mg2+影響很小，菌體生長旺盛；當Mg2+濃度從10 g/L增加到20 g/L時，溶液中最大氧化還原電位φ由610 mV降低至392 mV，這也可由圖1結果得到解釋，隨著Mg2+濃度增加，抑制了T. f菌的生長，導致對鐵的氧化能力降低，溶液中ρ(Fe3+)/ρ(Fe2+)

比值隨Mg2+濃度的增加而降低，根據式(4)進行計算，φ值減小，實驗結果與此相符。

圖2 Mg2+濃度對培養液氧化還原電位的影響Fig.2 Impact of Mg2+concentration on culture solution redox potential

2.3T. f菌生長動力學參數的確定

為確定不同 Mg2+濃度下細菌生長的最大比生長速率μmax、Monod飽和常數KM、Mg2+抑制常數KI的值，參考 GABRIEL[14]和 LIU[15]求解動力學方程的方法進行了相關參數的求解。

細菌比生長速率μ利用兩點法[16]求解，其滿足如下方程：

式中：X為溶液中細胞的數目；t為時間。

實驗采用等間隔取點分析，綜合式(5)可簡化為

動力學模型(2)可變形為

不同Mg2+濃度下T. f菌比生長速率和動力學參數的求解曲線如圖3所示。

通過1/μ?1/ρ(Fe2+)作圖，曲線y截距為1/μ′max，x截距為?1/KM，從而求得μ′max、KM。從曲線求解所得動力學模型(2)中細菌生長的動力學參數值見表1。

在T. f菌最常用的9K培養基中，MgSO4是不可缺少的主要成分之一，一般含Mg2+0.005 g/L左右，

因此可認為μmax=μ′max=0.192 h?1。

(1)的各動力學參數如表2。

表1 細菌生長動力學參數值Table 1 Kinetic parameters for growth of bacterium

表2 氧化亞鐵硫桿菌生長動力學參數Table 2 Kinetic parameters for growth of Thiobacillus ferrooxidans

圖3中各曲線的相關性較好，R2都大于0.97，證明所得動力學參數較好地符合了實驗結果。由表2可知，KM值基本不變，這與抑制劑對酶催化反應速率的非競爭性抑制中KM值保持恒定的結論相符[11]。而KI和μmax均有不同程度的變化，這一結果與實驗選擇的高Mg2+濃度條件有關。KI值的大小表示細菌對Mg2+的吸收親和力的大小，隨著Mg2+濃度的增加，細菌對Mg2+的親和力增大，導致Mg2+的非競爭性抑制作用也相應增加，KI值減小。μmax表示T. f菌的最大比生長速率，隨著Mg2+濃度的增加，Mg2+逐漸與酶活性中心以外的基團結合，故Mg2+與底物Fe2+兩者沒有競爭作用，但是由于Mg2+的結合可導致酶活性中心的結構發生改變(見圖 4)，消弱了底物 Fe2+和酶活性中心的結合，導致最大反應速率μmax的減小。

Mg2+濃度越高，形成不能轉化為產物的EI或IES越多，KI值越小，μmax降低的程度也越顯著，非競爭性抑制的反應機理可用式(8)表示。由于μmax降低，酶的反應速率也相應減小。非競爭性抑制作用的強弱取決于抑制物的絕對濃度，因而不能用增大底物濃度的辦法來消除此種抑制作用。

圖3 不同Mg2+濃度下T. f菌的比生長速率和動力學求解曲線Fig.3 Specific growth rate of T. f ((a),(b), (c), (d)) and dynamic processing curves ((a′), (b′), (c′), (d′)) at different Mg2+concentrations: (a), (a′) 0.004 9 g/L (basic medium); (b), (b′) 5 g/L; (c), (c′) 10 g/L; (d), (d′) 15 g/L

圖4 非競爭性抑制示意圖Fig.4 Schematic diagram of non-competitive inhibition

為了描述鎂離子濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長動力學的影響，在動力學模型中引入初始鎂離子濃度項ρ0和初始飽和常數KI0，動力學方程(1)可變形為

根據上述實驗數據，通過對μmax與KI的試差，得到氧化亞鐵硫桿菌在Mg2+濃度為0～15 g/L范圍內的生長動力學方程，如式(10)所示：

利用correl系數工具分析理論值與實驗室的相關系數為0.973，見圖5。該值表明以上動力學方程能較好地描述鎂離子濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長的影響。

圖5 比生長速率實驗室與模擬值的比較Fig.5 Comparison of laboratory and simulated values about specific growth rate

3 結論

1) 考察了在不同 Mg2+濃度下，氧化亞鐵硫桿菌的細菌濃度、ρ(Fe2+)、ρ(Fe3+)和溶液氧化還原電位φ隨時間的變化，結果表明氧化亞鐵硫桿菌(T. f)對Mg2+具有一定的耐受能力；當培養基中ρ(Mg2+)≤10 g/L時，Mg2+對細菌的生長活性影響很小；ρ(Mg2+)為 15 g/L時，開始產生延遲效應，抑制細菌生長；ρ(Mg2+)為20 g/L時，細菌生長完全受到抑制，并且隨著Mg2+濃度的增加，溶液氧化還原電位φ逐漸減小。

2) 利用基于存在非競爭性抑制的 Monod方程，建立了T. f菌在高鎂濃度下的生長動力學方程模型，得到了4個Mg2+濃度下細菌生長的動力學參數值，結果表明，隨著Mg2+濃度的增加，非競爭性抑制作用增加，消弱了底物Fe2+與酶活性中心的結合，KI和μmax逐漸減小，這也說明在一定Mg2+濃度下，氧化亞鐵硫桿菌才能正常生長。

3) 對實驗數據進行數學推導，得出該菌種在Mg2+濃度為0～15 g/L范圍內的生長動力學方程：

利用該方程得到的比生長速率理論值與實驗值的相關系數為 0.973，表明該方程能較好地描述Mg2+濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長情況的影響。

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(編輯 龍懷中)

Effect of magnesium ion concentration on growth kinetics of Thiobacillus ferroxidans

LIU Xin-wei1, FENG Ya-li1, LI Hao-ran2, CAI Zhen-lei1, YANG Zhi-chao1
(1. School of Civil and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083, China;2. State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)

Q935

A

1004-0609(2012)08-2353-07

國家自然科學基金資助項目(20876160)

2011-07-20；

2011-11-20

馮雅麗, 教授，博士；電話：010-62311181；E-mail: ylfeng126@126.com