近紅外光譜結合第一范圍標定法鑒定化學降糖原料藥

蔡 蕊， 王 世 盛， 孟 昱， 孟 慶 剛， 趙 偉 杰＊

(1.大連理工大學 制藥科學與技術學院，遼寧 大連 116024；2.沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016)

0 引 言

在制藥行業，對藥品生產原料的嚴格質量控制是確保藥品質量的重要前提.傳統的質量控制方法是將原料從原料倉庫中取出，送到分析中心或化驗室進行定性定量分析，再反饋到原料倉庫，合格后才允許發放，耗時較長，無法達到及時控制質量的目的.過程分析技術(process analytical technology，PAT)，可通過在生產過程中對產品進行及時檢測而達到實時監控質量的目的，而無需等到最后環節的成品檢驗進行質控[1～5].美國食品藥品管理局(FDA)也鼓勵制藥企業將過程分析技術作為現行生產質量管理規范(cGMP)，并廣泛地應用到藥品生產過程中[6].由于NIR光譜(near infrared spectroscopy)具有穿透力強、無需樣品預處理、無損、可遠距離檢測(光纖)等特點，在藥品質量控制、真偽鑒別方面已有廣泛的應用[7、8]，已成為一種重要的在生產過程中使用的過程分析技術[9].NIR光譜的應用，使得原料鑒別、檢驗工作可以直接在存儲車間倉庫或卸貨現場進行，甚至無需打開樣品內包裝，檢測時間只需幾秒鐘.但目前，該技術僅被少數國外制藥企業用于原料進貨入場驗收時的質量鑒別、原料投放前的質量分析，混合、干燥、壓片、包衣等過程檢測及終產品原位無損分析[10、11]，并且對降糖原料藥的定性分析，尚未見報道.本文結合第一范圍標定法對降糖原料藥NIR定性分析的可行性進行研究，試圖建立一種快速、準確、無需樣品預處理的鑒定8種降糖原料藥的方法，以期為制藥企業對降糖原料藥進貨驗收和投料前的品種鑒別提供新型的檢測手段.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗儀器與材料

MPA型傅里葉變換近紅外光譜儀(德國BRUKER公司)，配有積分球漫反射采樣系統、RT－PbS檢測器、樣品轉輪、透過單元、光纖探頭測樣器－銦鎵砷(InGaAs)檢測器、OPUS 6.5操作軟件.

降糖原料藥鹽酸二甲雙胍、鹽酸吡格列酮、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈、格列本脲、格列齊特、格列吡嗪，每個品種各10批次，均由輝瑞制藥有限公司大連工廠提供.

1.2 近紅外光譜采集

8種降糖原料藥固態粉末的近紅外光譜圖采集(見圖1):取鹽酸二甲雙胍、鹽酸吡格列酮、格列吡嗪、格列齊特、格列美脲、格列喹酮和瑞格列奈原料粉末(無需去除聚乙烯塑料包裝)，使用漫反射光纖探頭壓住藥粉，在12 500～4 000cm－1進行光譜采集，光譜分辨率為8cm－1，樣品掃描次數為16次，背景掃描次數為16次，溫度23～25℃，溫度變化每小時不超過1℃，一天不超過2℃.

8種降糖原料藥標準品溶液的近紅外光譜圖采集:配制鹽酸二甲雙胍、鹽酸吡格列酮、格列吡嗪、格列齊特、格列美脲、格列喹酮、格列本脲和瑞格列奈的最大濃度溶液(鹽酸二甲雙胍濃度為20 mg／mL；鹽酸吡格列酮、格列齊特和格列本脲濃度為10mg／mL；格列喹酮和瑞格列奈濃度為5 mg／mL；格列吡嗪和格列美脲濃度為2mg／mL)，裝入石英液體樣品池中，采用透射方式在12 500～4 000cm－1進行光譜采集，除光譜分辨率為16 cm－1外，其他參數同上.

圖1 固態降糖原料藥的近紅外光譜圖Fig.1 NIR spectra of solid oral hypoglycemic APIs

1.3 光譜預處理方法

掃描共得到96張光譜圖，其中64張光譜圖作為訓練樣品集進行模型的建立.采集8種降糖原料藥標準品固態粉末的近紅外光譜圖時，由于樣品顆粒大小、均勻性、儀器狀態等因素的影響，光譜基線會產生偏差或漂移，為消除這些不良影響，原始光譜圖需要經過預處理.常用的預處理方法有消除常數偏移量、減去一條直線、矢量歸一化、最小－最大歸一化、多元散射校正、內部標準、一階導數、二階導數、一階導數＋減去一條直線、一階導數＋矢量歸一化、一階導數＋MSC，共11種.而后以得到最大的選擇性S(至少大于2，越大越好)為目標，選擇最佳波數范圍、算法進行建模.

2 結果與討論

2.1 處理方法

定性分析的目的是判定測試譜圖與庫中參考譜圖的差別.必須先定義測試譜圖相似性的方法，以及一個閾值.這個閾值用來判定一張譜圖是否與參考譜圖相似或相同.

標準算法和因子法是定性分析時常用的兩種基本算法，分析過程中，兩種算法將測試譜圖同所有參考譜圖進行比較.比較結果即是匹配值，也對應為光譜圖距離D.兩張譜圖越匹配，則距離越短.完全相同的譜圖匹配值為零(例如:參考譜圖對自己測試).

標準算法是用歐氏距離D來計算光譜圖距離，計算公式為

通過歐氏距離來比較譜圖的匹配度，a(k)和b(k)是譜圖A、B的縱坐標值，即光譜強度.

因子法是先將譜圖表示為因子譜的線性組合，a＝T1af1＋T2af2＋T3af3＋…，fi為因子譜，各因子譜正交，T為每一個因子譜的系數，其數值表征相應因子譜對所表征譜圖的貢獻.再用因子T(也稱得分)來計算光譜圖距離，公式為

然后計算各品種訓練集中每一樣品光譜圖到該樣品平均光譜圖的距離(H)，并據此計算每一樣品的閾值(DT):

其中max(H)為測定的樣品光譜圖中到該樣品平均光譜圖的最大距離；Sdev為H的標準偏差；X為系數，一般根據經驗X選用0.25.使用上述公式來比較譜圖的匹配度.

選第一范圍標定法則光譜圖距離的最小和最大值由第一頻率范圍決定.然后計算其他頻率范圍的距離，其值按相同范圍標定，也就是與第一頻率范圍同樣的最小和最大值.第一范圍標定法與標準算法和因子法不同，重疊譜區沒有合在一起.例如:如果設定第一頻率區間為1 500～1 200 cm－1、第二區間為1 500～1 400cm－1，它們不會組合成一個頻率范圍，計算光譜圖距離時1 500～1 400cm－1的數據點被使用兩次.矢量歸一化預處理方法不能與第一范圍標定法一起使用；因為它是自動進行的.與標準算法和因子法相反，矢量歸一化是對每個頻率范圍單獨計算的，然后從這些值中計算出平均距離.

標準算法是用歐氏距離表示光譜圖距離，而第一范圍標定法使用相關因子.

計算Pearson相關因子r，即測出譜圖A和B之間的相關性:

對每一個頻率范圍分別計算相關性.對某一頻率范圍全部數據點k求和:an和bn是歸一化的譜圖強度，由歸一化步驟得到

式中:am和bm是響應頻率范圍的平均光譜強度；相關因子r的范圍在－1(譜圖相反)到＋1(譜圖相同)之間.

相關因子按照下式變換成光譜圖距離:

光譜圖距離D值落在0(譜圖相同)和2 000(譜圖相反)之間.

模型的結果一方面看所有建模光譜圖是否被唯一鑒定，另一方面還要看不同庫之間的選擇性，一般用S表示:

S為選擇性，D是兩個庫平均光譜之間距離，T1與T2為兩個庫的閾值.S＜1:類交叉；S＝1:類之間有接觸；S＞2:類之間可以完全分開，因此S越大，類之間差別越大，模型預測的準確性越高.根據實驗效果，選取合適的算法.

在建立8種降糖原料藥固態模型時，將采集到的原始光譜圖進行各種不同預處理方法和分析方法的調試，初選定波譜范圍12 072.3～4 000.0 cm－1，選擇最優參數，確定的最優光譜預處理方法為一階導數，分析方法為第一范圍標定法.

在建立8種降糖原料藥溶液的近紅外光譜模型時，需將原料藥溶解，由于溶劑甲醇的吸收很強，原始譜圖所顯示的信息，除幾處有細小的差別外，用肉眼無法辨別其與甲醇的吸收譜圖的區別(如圖2、3所示)，必須經過光譜預處理方法對譜圖進行預處理，選擇較好的結果，建立定性分析模型.經過調試，選定掃描波譜范圍10 235.7～4 237.2cm－1，確定最優預處理方法為一階導數，分析方法為第一范圍標定法.

圖2 液態降糖原料藥的近紅外光譜圖Fig.2 NIR spectra of liquid oral hypoglycemic APIs

圖3 純甲醇溶劑的近紅外光譜圖Fig.3 NIR spectra of pure methanol solvent

2.2 定性模型的建立

采用近紅外漫反射光譜法對8種固態降糖原料藥建立定性分析方法，在掃描譜區范圍12 072.3～4 000.0cm－1，使用一階導數，結合第一范圍標定法進行建模.將8種降糖原料藥配制成對應濃度的溶液，采用近紅外透射光譜法對其建立定性分析方法，在掃描譜區范圍10 235.7～4 237.2cm－1，使用一階導數，結合第一范圍標定法，建立其分析模型.

對固態、液態的降糖原料藥進行NIR定性分析，從表1中可以看出，固態模型的S均大于149.161，遠大于2，說明該模型可將固態原料完全地分離；從表2中可以看出，有6種溶液的S大于2，另外2種的S在1和2之間，這說明格列吡嗪、格列喹酮的甲醇溶液應用近紅外光譜法鑒別結果并未得到完全的分離，可能是因為2種降糖原料藥在甲醇中的溶解度有限，無法達到一定的濃度，甲醇溶劑在9 000～4 000cm－1都有很強的吸收，被檢測組分濃度過低則受到甲醇吸收峰的干擾更為顯著，無法體現特征信號，致使計算結果不如固態模型的好.因此，相比固態降糖原料藥模型，液態降糖原料藥的定性模型結果較差.

表1 固態降糖原料藥定性模型建立結果Tab.1 The qualitative model results of solid oral hypoglycemic APIs

表2 液態降糖原料藥定性模型建立結果Tab.2 The qualitative model results of liquid oral hypoglycemic APIs

2.3 模型的驗證

8種固態降糖原料藥定性分析模型的驗證:取8種原料藥樣品，利用已經建立好的模型對未知樣品進行近紅外定性分析，當匹配值(測試光譜圖與參考光譜圖之間的光譜圖距離)小于相應的閾值，而且所有其他物質的匹配值都大于相應的閾值時，說明被成功鑒定.以一種降糖藥為例，分析結果如表3所示，未知樣品1只有與鹽酸二甲雙胍匹配時匹配值小于閾值，因此被鑒定為鹽酸二甲雙胍.

表3 未知樣品1的定性評價結果Tab.3 The qualitative evaluation result of unknown Sample 1

8種降糖原料藥溶液的近紅外分析模型的驗證方法同上，未知樣品均被鑒定成功，說明此定性模型可以對8種降糖原料藥進行定性分析.

3 結 論

應用近紅外光譜法結合第一范圍標定法，建立了8種降糖原料藥(鹽酸二甲雙胍、鹽酸吡格列酮、格列吡嗪、格列齊特、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈、格列本脲)的定性模型，使用固體光纖及液態透射方式采集譜圖，分別在12 072.3～4 000.0cm－1、10 235.7～4 237.2cm－1，建 立NIR 8種降糖原料藥固態及液態的定性分析模型，兩個模型對未知原料藥的鑒別結果準確率均為100%，固態分析模型得到的鑒別結果要好于液態模型.結果表明所建立的模型可以實現對8種降糖原料藥快速準確的鑒別，比傳統檢測方法更加快速、簡便，適用于制藥企業在原料進廠、車間投料前逐桶定性鑒別，擴大了NIR在生產過程前端的應用，為降糖原料藥質量控制提供簡便、可靠的過程分析技術.

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