離體SH－SY5Y細胞內酸化對早老素－1表達的影響＊

高芳峭，方伯言

（1.遼寧醫學院研究生學院，遼寧錦州 121001；2.遼寧醫學院附屬第一醫院神經內科，遼寧錦州 121001）

阿爾茨海默病（alzheimer′s disease，AD）是一種以進行性記憶力減退、認知功能障礙為特征的中樞神經系統退行性變性疾病。主要病理改變是在大腦中于記憶和認知相關區域出現β淀粉樣蛋白（amyloid proteinβ，Aβ）聚合產生的纖維沉積形成老年斑并引起神經受損等一系列相關的病理改變［1］。Aβ是由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）分別通過β－分泌酶和γ－分泌酶作用后生成［2］。過去對β－分泌酶研究的比較清楚，但對γ－分泌酶的結構與特性卻一直不甚清楚。近年來一些研究提示早老素－1（Presenilin 1，PS1）是γ－分泌酶水解APP所必須的，起到重要的催化作用，甚至可以說PS1就是未知的γ－分泌酶［3－5］。AD中神經細胞死亡是由細胞凋亡介導的，由于各種物理和化學刺激誘導的細胞凋亡都出現細胞內酸化，推斷AD的神經細胞凋亡的同時也伴有細胞內酸化。有研究表明這些酶在酸性條件下具有較高的活性，但相關的研究和證據還比較少。酸堿調節基因－胞膜離子交換蛋白Na＋－H＋交換泵（Na＋－H＋exchanger，NHE）基因在維持細胞內環境中發揮重要作用［7］，因此作者應用pAd－miR－NHE1腺病毒顆粒感染SH－SY5Y細胞，抑制細胞表面酸堿調節基因NHE1的表達［8］，使細胞內pH值降低，另外降低細胞培養基pH值，同樣降低細胞內pH值，觀察分析PS1在pH值降低的細胞內的表達，進一步了解細胞內pH值對PS1功能和活性的影響，探討AD的發病機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與miRNA腺病毒轉染SH－SY5Y細胞 人神經母細胞瘤SH－SY5Y細胞（中國醫科大學贈），采用10%的FBS的高糖DMEM培養基（GIBCO），在37℃、5%CO2培養箱內進行培養。對腺病毒pAd－miR－NHE1和pAd－miR－NC轉染細胞進行鑒定后［8］，分別轉染細胞，為NHE1基因抑制組（NHE1組）和陰性對照組（NC組）。將用正常培養基常規培養的SH－SY5Y細胞按106細胞密度接種于培養瓶中，當達到80%～90%融合時按MOI值為160進行轉染（細胞的感染率在90%左右為最佳 MOI值），將準備好的腺病毒與無血清無抗體的培養基按一定比例混合（取50μL腺病毒和2 950μL無血清無抗生素的培養基），混勻，放置37℃、5%CO2培養箱內吸附1h后，PBS洗滌后改用2%血清雙抗培養基于37℃、5%CO2培養箱內培養24～48h后收集細胞。

1.2 酸化細胞外環境，選出最適細胞生長的酸性培養基 降低細胞培養基pH值，以pH值6.8為基準，依次降低0.5形成5個梯度pH值的培養基，從接種開始每12小時計數1次，至72h，共6個時間點。細胞系以平均1×104個細胞密度接種于在24孔細胞板上，各梯度每個時間點重復3個孔；接種后12h開始用0.25%胰蛋白酶消化每個梯度的第1組，制成1 mL細胞懸液，進行計數，取3個孔的平均值，至72h結束，通過光鏡觀察細胞生長，根據測得的數值，繪制生長曲線，進行培養細胞的生長曲線分析，確定最適細胞生長的酸性培養基。

1.3 細胞內pH值測定 用緩沖液求標準曲線，制作高鉀緩沖液，將高鉀緩沖液分裝6只試管中，每只5mL，分別將pH值調至不同的值，分別為4.8、5.3、5.8、6.3、6.8、7.3，6只試管中分別加入Nigericine和BCECF，濃度分別為30μmol／L和0.25μmol／L，取正常SH－SY5Y細胞胰酶消化，制成單細胞懸液，PBS洗2次，分別加入相同的細胞與上述試管中，37℃孵育12min，應用熒光分光光度計記錄490nm／440nm熒光強度比值（FIR），求出pH值的標準曲線。將各組細胞胰酶消化，1 000r／min離心5min，棄上清液，生理鹽水洗1次，BCECF／AM／DMSO濃度為2mg／mL加入培養基中，37℃孵育細胞12min，用熒光分光光度計記錄490nm／440nm熒光強度比值，根據標準曲線求出細胞內pH值。

1.4 ELISA法定量分析細胞內的PS1 各條件下的細胞系以2×106個細胞密度接種于培養瓶中，分別培養48h，貼壁細胞用冷PBS洗2次，用預冷的RIPA裂解液50mmol／L，刮下細胞，冰上裂解30min，將裂解產物以14 000r／min離心5min收集上清液，裂解液中PS1的含量用ELISA試劑盒（RD）測量，所有操作按試劑盒說明書進行，每組樣品做3個復孔。

1.5 Western Blotting 取各條件下穩定表達PS1的貼壁細胞用冷PBS洗1次，加入預冷的RIPA裂解液，刮下細胞，在冰上裂解30min，將裂解物離心收集上清液。蛋白20μg／孔上樣于10%SDS－PAGE，每組樣品重復兩個孔，電泳分離后，轉至PVDF膜上，分別與一抗兔抗PS1單克隆抗體（Bioworld Technology，USA）（1∶800），兔抗β－actin單克隆抗體（碧云天公司）（1∶500）孵育4℃過夜。二抗用辣根過氧化物酶HRP標記的羊抗兔Ig（碧云天公司）（1∶500）孵育1h，加入適量的BCIP／NBT（碧云天公司）染色液顯色。

2 結 果

2.1 選出適合細胞生長的酸性培養基 當pH值為6.3時SH－SY5Y細胞很快貼壁，接種后24h內培養細胞的增殖速度不甚活躍，大約36h開始，倒置顯微鏡下可以觀察到貼壁細胞增殖迅速，48～72h這些細胞增殖進一步擴大，鋪滿瓶底，鏡下細胞呈多角形。當pH值為6.8或5.8時，情況類似，僅增值速度稍慢，于72h后細胞數約為前者的50%。當pH值為5.3時，細胞卻貼壁不牢，部分懸浮，12h觀察細胞數減為接種時的一半，以后細胞數量不增加或稍增加后隨即停止，形態極不規則。當pH值為4.8時，12h觀察鏡下細胞成為圓球形懸浮細胞，飄蕩在培養液中，大部分細胞死亡。通過觀察，適合細胞生長的酸性培養基pH值為6.3。

2.2 細胞內pH值降低的SH－SY5Y細胞模型建立 根據熒光分光光度計測得的緩沖液490nm／440nm熒光強度比值，計算出pH值標準曲線的直線回歸方程為Y＝0.464 1 X＋4.088 7（r＝0.94），再根據各組細胞的490nm／440nm熒光強度比值在回歸方程上計算出對應的細胞內pH值（表1）。正常對照組細胞內pH值為7.27±0.02，而NHE1組和酸化培養基組細胞內pH值分別為6.62±0.02和6.99±0.02，差異有統計學意義。NHE1組和酸化培養基組細胞內pH值明顯降低，說明模型成功建立，正常對照組和NC組細胞相比細胞pH值無明顯差別。

表1 各組細胞內pH值情況

2.3 PS1含量測定 根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程為Y＝0.001 X＋0.419（r＝0.87），再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度（表2）。從結果中可以看出，細胞內PS1的含量受細胞內pH值影響：正常對照組和NC組胞漿內PS1含量表達較低，NHE1組和酸化培養基組細胞內PS1含量均較正常對照組和NC組明顯增多，但NHE1組與酸化培養基組細胞內PS1含量變化無明顯差異（P＞0.05），正常對照組與NC組細胞內PS1含量變化無明顯差異（P＞0.05）。此結果表明，PS1含量與細胞內pH值呈依賴關系，SH－SY5Y細胞內pH值降低可使胞漿內PS1生成量增加。

表2 ELISA法檢測各組細胞內PS1蛋白濃度值

2.4 PS1的表達 利用抗PS1單克隆抗體進行Western Blotting檢測各組細胞內PS1的表達，可識別相對分子質量大約為60×103的PS1。在所檢測的4組中，PS1都可顯現（圖1），前兩組的條帶很模糊，可能由于蛋白含量較少的緣故，后兩組條帶清晰顯現。后兩組細胞內PS1表達量與前兩組細胞比較統計學分析有顯著差異，正常細胞組和NC組PS1表達量無明顯差異（P＞0.05），NHE1組與酸化培養基組細胞內PS1表達量無明顯差異（P＞0.05），結果顯示與ELISA結果相一致。見表3。

圖1 PS1的Western Blotting檢測

表3 Western Bloig檢測各組細胞PS1蛋白表達凈OD值

3 討 論

隨著人口老齡化，老年期癡呆越來越引起人們的關注。現在雖然認識到AD的發病機制是由于患者體內產生過多Aβ并在大腦中形成纖維沉積所致，但對Aβ如何過多產生的機制還并不清楚。β－分泌酶和γ－分泌酶的活性異常可能是導致Aβ增多的原因。細胞凋亡被認為與AD中神經元細胞退化過程中幾個階段有關，所以有些研究者認為AD中神經元細胞死亡是由細胞凋亡介導的。細胞內酸化作為細胞凋亡的一個重要特征已被實驗所證實，這些實驗結果表明，應用各種外源性的物理和化學刺激誘導各種不同的細胞凋亡的同時都伴有出現細胞漿的酸化。也就是說AD的神經細胞呈細胞內酸化狀態。

細胞內pH值是反映內環境穩定性的一項指標，它在調節細胞新陳代謝中起重要作用。體內眾多的酶類同樣受到最基本的化學調節—pH值的調節，pH值直接影響到酶的活性、表達及構象。這使作者產生一個設想，細胞內pH值的變化可能對APP裂解—γ－分泌酶的功能產生影響，即細胞內pH值降低使γ－分泌酶裂解APP生成Aβ的活性增高。

γ－分泌酶是一個包含早老素在內的蛋白復合體，這是Aβ產生所必須的一個酶。PS包括PS1和PS2，PS1廣泛分布于人的腦和外周組織，PS2則主要表達于人的心肌、骨骼肌等外周組織，對AD的作用不大［9－10］。因此，在本實驗中選擇的指標只包括了PS1，而不包括對AD作用不大的PS2。現在有越來越多的研究顯示PS1可能就是預期的γ－分泌酶，體內實驗發現［11］，敲除編碼PS1基因的小鼠γ－分泌酶的活性降低80%，Aβ含量大大降低，PS1和PS2基因雙敲除的小鼠，其γ－分泌酶活性完全被抑制，這些均表明PS1是γ－分泌酶水解APP所必須的，因此PS1是γ－分泌酶的主要組成部分，起到重要的催化作用，是γ－分泌酶活性基團。本研究通過建立細胞內酸化的SH－SY5Y細胞模型，探討γ分泌酶主要成分PS1在胞漿pH值降低的細胞中的表達及其活性是否增高，進而分析細胞內pH值變化與γ－分泌酶活性的關系。

結果顯示細胞內pH值降低對PS1的表達及活性有一定影響作用。本實驗結果表明，與正常SH－SY5Y細胞相比，NHE1受抑制的細胞和用酸性培養基培養的細胞的胞漿內PS1含量及蛋白表達均顯著增高，而NHE1未被抑制的NC組細胞的胞漿內PS1含量及蛋白表達則無顯著變化，與預期的二者之間變化關系是一致的。

從本研究看，細胞內pH值降低的細胞胞漿內PS1濃度及蛋白表達是增加的，說明PS1的活性在酸化細胞中是明顯升高的，據此推測，細胞內pH值降低使γ－分泌酶的活性升高，在AD患者腦內γ－分泌酶的活性也是如此。因為γ－分泌酶活性升高在AD發生中具有關鍵性的作用，所以作者認為γ－分泌酶含量和蛋白水平的升高可能是高齡人群易發AD的一個關鍵性的生物學因素。

綜上所述，本實驗結果進一步支持了AD中γ－分泌酶的活性異常是導致Aβ增多的原因之一。

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