廣州地區非綜合征性耳聾患者耳聾相關基因突變分析

賈 蓓，李 琦，宋蘭林，劉思平，鐘 梅△

（南方醫科大學南方醫院：1.婦產科產前診斷與遺傳病診斷技術中心；2.耳鼻喉科，廣州 510515）

耳聾是嚴重影響人類健康和生活的疾病，在新生兒中的發生率達1‰～3‰［1］。2006年全國殘疾人抽樣調查結果顯示我國現有聽力殘疾者在2 780萬人，每年新生聾兒3萬，居各類殘疾之首［2］。耳聾可分為遺傳性和非遺傳性，60%以上的新生聾兒是由遺傳因素導致的［3－4］。遺傳性耳聾具有廣泛的遺傳異質性，根據是否伴有耳外組織的異常或病變可將其分為綜合征性耳聾（syndromic hearing loss，SHL）和非綜合征性耳聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL）［5］。NSHL占70%以上，目前已定位了100多個NSHL相關位點，克隆了68個致病基因，包括40個常染色體隱性基因、25個常染色體顯性基因、3個X連鎖基因，每個基因中均散在多個耳聾突變位點。

不同種族不同地區的人群，耳聾基因突變熱點有明顯的差異。在歐美人群中，50%的NSHL由GJB2基因突變導致；其次是SLC26A4基因，5%～10%的NSHL與它有關；另外MYO15A、OTOF、CDH23和TMC1也是常見的耳聾致病基因［6］。而在中國人群中，聾病分子流行病學調查顯示GJB2、SLC26A4、線粒體基因（A1555G和C1494T突變）是中國NSHL患者最常見的3個致病基因，且南北各地區間各基因檢出率差異較大［7－8］。為了了解廣州地區NSHL患者發病的分子機制，探討耳聾臨床表型與基因型之間的關系，本文應用遺傳性耳聾基因芯片對廣州地區的NSHL患者進行了常見耳聾相關基因的突變篩查。

1 資料與方法

1.1 一般資料 受檢的耳聾患者均來自廣州市及周邊縣市，共52例，全部為漢族，男32例，女20例，就診年齡2～42歲，平均（18.2±3.5）歲。詳細了解病史及耳聾相關信息，如耳聾發病年齡、誘因、用耳毒性藥物史，頭部外傷史、家族史等，進行全身、專科及影像學檢查。結合病史排除其他癥狀和體征，52例患者均被診斷為NSHL。根據純音測聽結果，52例均為雙側感音神經性耳聾，46例重度以上耳聾（70dB以上），6例中度耳聾（41～70dB）。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑及儀器 小量基因組DNA抽提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。晶芯九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（微陣列芯片法），PCR儀（ABI 9700），芯片雜交儀（Bio MixerⅡ），芯片洗干儀（SlideWasher TM8），芯片掃描儀（Lux－Scan 10K－B）購自博奧生物技術有限公司。

1.2.2 DNA提取 患者或家屬簽署知情同意書后，采集受檢者外周血2mL，用小量基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，并進行濃度及純度檢測，滿足濃度100～200ng／μL，純度OD260／280＝1.7～2.0。

1.2.3 耳聾基因芯片檢測 應用遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒對GJB2、SLC26A4、mtDNA12srRNA和GJB3四個耳聾相關基因的9個致聾突變位點進行檢測。這9個位點為：GJB2基因的35delG，176del16，235delC，299delAT；SLC26A4基因的2168A＞G，IVS7－2A＞G；線粒體12SrRNA的1494C＞T，1555A＞G；GJB3基因的538C＞T。檢測過程主要分3個步驟：多重不對稱等位基因特異性PCR，擴增產物跟芯片雜交，芯片結果的掃描和判讀。具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4 統計學處理 收集資料后，數據分析采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

52例耳聾患者中，語前聾24例（其中先天性耳聾20例）；語后聾20例，平均發病年齡（4.02±1.35）歲；耳聾發病年齡不詳者8例。聾前有明確耳毒性藥物應用史者18例，其中語前聾8例，語后聾10例，用藥年齡主要集中在嬰幼兒期，用藥原因多為感冒、發燒和腹瀉，以應用氨基糖甙類及水楊酸類藥物多見。有8名患者有明確的家族史，其中2名男性患兒是同胞兄弟為線粒體母系遺傳，其余6名患者來自不同的家系均為隱性遺傳。有5名患者顳骨CT顯示前庭導水管擴張。

應用基因芯片方法在52例耳聾患者中共檢出18例帶有耳聾基因突變，檢出陽性率為34.6%，見表1。其中，檢出GJB2基因突變9例，包括235delC純合突變6例，雜合突變2例，299delAT純合突變1例；SLC26A4基因突變5例，IVS7－2A＞G純合突變4例，雜合突變1例；線粒體12SrRNA A1555G均質突變4例。44名散發病例中檢出13例（29.5%）攜帶突變，8名有家族史的患者檢出5例攜帶突變（62.5%），見表2。

表1 廣州地區52例NHSL患者耳聾基因突變檢出結果

表2 18例攜帶耳聾基因突變患者基因型及表型的關系

24例學語前聾患者中檢出11例帶有耳聾基因突變（45.8%），20例學語后聾患者檢出7例（35.0%），兩組比較χ2＝0.530，P＝0.467（雙側），差異無統計學意義，認為學語前聾與學語后聾耳聾基因突變的檢出率無差異。

18例帶有耳聾基因突變的患者中，攜帶GJB2基因突變語前聾患者7例（77.8%），攜帶SLC26A4基因突變語前聾患者3例（60.0%），攜帶線粒體12SrRNA基因突變語前聾患者1例（25.0%），3組比較χ2＝3.293，P＝0.193（雙側），差異無統計學意義，認為3組中語前聾患者的比例無差異。

5名前庭導水管擴張患者均檢出攜帶SLC26A4基因突變。4名線粒體12SrRNA A1555G均質突變患者均是應用氨基糖甙類藥物后致聾。

3 討 論

耳聾的相關基因眾多，遺傳異質性強，但大多數耳聾患者是由少數幾個基因突變導致的，這為臨床開展耳聾基因診斷及產前診斷提供了檢測目標基因。鄭文波等［9］、Dai等［10－12］、劉新等［13］在國內進行了大規模聾病分子流行病學研究，調查結果顯示GJB2、SLC26A4、線粒體基因是中國人遺傳性耳聾最常見的3個致病基因，21%的聾人帶有GJB2基因突變、14.5%的聾人帶有SLC26A4基因突變、3.4%和0.6%的聾人分別帶有線粒體DNA A1555G和C1494T突變。在王國建等［14］的研究中，根據流行病學結果開發的芯片能檢出42.41%NSHL患者。在本研究中，應用基因芯片方法對廣州地區的NSHL患者的檢出陽性率為34.6%，17.3%的耳聾患者攜帶GJB2基因突變，9.6%的患者攜帶SLC26A4基因突變，7.7%的患者攜帶線粒體12SrRNA A1555G突變；檢出陽性率、GJB2基因及SLC26A4基因的攜帶率均低于全國平均水平，而線粒體基因突變的攜帶率明顯高于全國平均水平。這些差異的原因可能是：（1）中國人基因在地域上存在差異性。中國地域廣大，人口、民族眾多，人種來源復雜，人群遺傳背景在各地區存在差異。在Dai的研究中，研究對象65%以上為北方人群，南方人群僅局限在幾個省市，在反映全國聾病分子流行病學趨勢上傾向于北方人群。（2）基因芯片相對于傳統酶切及測序等方法的檢出率稍低（42.41%，44.30%），可能漏診了基因其他位點突變的患者。（3）此次調查研究樣本量不夠大，存在抽樣誤差。

GJB2基因突變是導致NSHL最常見的原因，中國人群中學語前聾患者26%～33%由GJB2突變所致［9］，廣州地區29.2%（7／24）的語前聾患兒由GJB2異常引起，最常見的致病位點是235delC，與國內外報道相同。本研究組中GJB2突變的NSHL患者，耳蝸神經和聽覺中樞完整，如果接受人工耳蝸植入聽力語言康復的效果將會較好，GJB2突變篩查是人工耳蝸植入術前一項重要的療效預判檢查［15］。

SLC26A4基因突變將導致大前庭導水管擴張綜合征（enlarged vestibular aqueduct syndrome，EVAS）及Pendred綜合征。我國約97%的EVAS患者能夠檢出SLC26A4基因突變，主要突變是IVS7－2A＞G。本研究中，5例前庭導水管擴張患者均檢出攜帶SLC26A4基因突變，4例IVS7－2A＞G純合突變，1例雜合突變。雖然有30%攜帶SLC26A4單條等位基因突變的患者會表現為前庭導水管擴張［11］，但雜合突變患者還應進一步檢測SLC26A4基因其他位點，以明確基因型。前庭導水管擴張的患者，內耳環境脆弱，任何引起顱內壓變化的因素如頭部外傷、感冒發熱等就能引起EVAS患兒聽力下降。本研究中2例EVAS患者出生時聽力正常，在感冒、頭部震蕩后出現聽力下降，聽力下降為波動性，總的趨勢是越來越差。如果我們能在兒童早期進行SLC26A4基因篩查，不僅能明確病因，還可以提醒家長注意日常防護，保護殘余聽力，延緩患兒聽力下降的速度。

線粒體mtDNA A1555G突變導致的耳聾主要與氨基糖甙類藥物使用有關。突變攜帶者對氨基糖甙類藥物很敏感，低劑量使用就會出現耳鳴，甚至致聾［16］。廣州地區NSHL患者中的線粒體12SrRNA A1555G檢出率（7.7%）明顯超過全國平均水平（3.4%），表明在廣州地區應該對線粒體mtDNA突變給予更多的重視。本研究中4例患者均是在應用氨基糖甙類藥物后致聾，其中2例還是同胞兄弟，這提示在應用耳毒性藥物治療兒童疾病前，要注意了解患兒耳聾的家族史，有條件時應進行線粒體12SrRNA A1555G及C1494T位點篩查，避免一針致聾，全家多人因藥致聾的慘劇發生。

通過分析廣州地區NSHL患者相關耳聾基因突變，初步了解了廣州地區耳聾患者發病的分子機制，在一定程度上豐富了中國人群耳聾基因突變頻率和分布圖譜。深入了解耳聾患者發病的遺傳背景對在廣州地區開展耳聾早期診斷、遺傳咨詢、及時干預和治療至關重要。

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