pcDNA3.1／Cx43真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)

李嘉杰，聞海兵，鄒樹峰，嚴(yán) 劍，洪 濤

（1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生院 330000；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 330006）

縫隙連接蛋白（connexin，Cx）可能與體內(nèi)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程有著密切的聯(lián)系，Cx43作為Cx家族最常見的一種，其表達(dá)量的改變直接影響縫隙連接的功能，導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤的發(fā)生。前期體外研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Cx43cDNA的C6細(xì)胞縫隙連接功能增強(qiáng)，化療的旁觀者效應(yīng)明顯放大。然而，Cx43在體內(nèi)是否也有同樣的作用還不得而知，為此本研究通過(guò)構(gòu)建Cx43真核表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)，從體內(nèi)觀察Cx43對(duì)腦膠質(zhì)瘤侵襲性的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞由杭州生物技術(shù)公司提供。主要試劑：pcDNA3.1載體、LipofectamineTM－2000、TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，感受態(tài)細(xì)胞DH5α、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶，凝膠回收試劑盒、B型小提質(zhì)粒試劑盒及G418購(gòu)自上海天根生化科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，兔抗Cx43Total購(gòu)自美國(guó)Zymed公司，兔抗β－actin為美國(guó)Chemicon公司產(chǎn)品，羊抗兔第二抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和青鏈霉素混合液為美國(guó)HyClone公司產(chǎn)品。主要儀器：倒置相差顯微鏡（日本Olympus）、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國(guó)Bio－rad）、紫外分光光度計(jì)（美國(guó) Bio－rad）、凝膠成像儀（美國(guó)Bio－rad）。

1.2 pcDNA3.1／Cx43真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 U251細(xì)胞總RNA的提取 按RNeasy Mini Kit（德國(guó)QIAGEN）說(shuō)明書提取總RNA。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcriptase－PCR，RT－PCR）擴(kuò)增人Cx43基因蛋白編碼序列子 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)人Cx43基因序列（CR541660），利用Vector NTI Advance 10軟件自行設(shè)計(jì)Cx43基因的全長(zhǎng)引物（上游：5′－GTG CTA GCT TAT GGG TGA CTG GAG CGC C－3′；下 游：5′－GCG GGT ACC CAG GAT CTC CAG GTC AT－3′，分別帶有 NheⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)1 168bp）。β－actin引物采用上海閃晶分子生物技術(shù)研究所的β－actin序列（上游：5′－CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC－3′，下游：5′－TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)150bp）。兩對(duì)引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以提取的總RNA為模板，用ReverTra Ace－αTMKit（天根生化科技有限公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，PCR擴(kuò)增Cx43編碼序列，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性60s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像儀分析并進(jìn)行照相。用DNA凝膠回收試劑盒（安徽U－GENE公司）切膠回收Cx43PCR產(chǎn)物。

1.2.3 pCMV－Cx43cDNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 NheⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)Cx43RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pcDNA3.1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收后用高效DNA連接酶，16℃連接16h；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌，G418平板篩選。挑取陽(yáng)性克隆，搖菌過(guò)夜，提取質(zhì)粒。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1／Cx43。

1.2.4 pCMV－Cx43cDNA重組質(zhì)粒鑒定 NheⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切及雙酶切，并送天根生化科技有限公司（北京）進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3 pcDNA3.1／Cx43重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞及G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

1.3.1 U251細(xì)胞的培養(yǎng) U251細(xì)胞在含10%FBS，37℃、95%濕度、5%CO2的 Dulbecco′s改良 Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′medium，DMEM）中常規(guī)培養(yǎng)，每周傳代3次。

1.3.2 U251細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶－乙二胺四乙酸（美國(guó)Gibco公司）消化后吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)染24h前將4×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到90%～95%。將LipofectamineTM－2000 10μL加入240μL無(wú)血清DMEM中混勻，室溫放置5min；取pcDNA3.1／Cx431重組質(zhì)粒4μg加入無(wú)血清DMEM中混勻（總量250μL），將上述2種液體混勻制成質(zhì)粒－脂質(zhì)體混合物，室溫放置20min。用無(wú)血清DMEM洗滌細(xì)胞3次，將質(zhì)粒－脂質(zhì)體混合物逐滴滴加至6孔板中，輕輕混勻，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5h后更換為完全培養(yǎng)基（含10%FBS）；24h后按1∶6傳代；24h后，待細(xì)胞貼壁，換為含800μg／mL G418的完全培養(yǎng)基篩選3周，得到抗性克隆，用無(wú)菌移液器槍頭挑取單克隆繼續(xù)培養(yǎng)2周以上，以獲得穩(wěn)定細(xì)胞系。

1.4 RT－PCR檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞中Cx43的基因表達(dá)水平 用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性60s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。同時(shí)，內(nèi)參β－actin以等量的RNA為模板，同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共28個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。

1.5 Weston blot檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)水平 用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，取20μL體積上樣，積層膠電泳15min，電壓120V；分離膠電泳45min，電壓180V；轉(zhuǎn)膜90min，電流350mA；5%的含吐溫－20的 Tris緩沖液（Tris－buffered saline with Tween－20，TBST）脫脂奶粉室溫下封閉2h；加入兔抗Cx43抗體4℃孵育過(guò)夜；然后用TBST液洗滌3次，每次10min，加入第二抗體室溫下孵育4h，再用TBST液洗滌3次，每次10min，曝光。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增獲取Cx43序列 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后得到大小約1 168bp的特異性單一條帶，經(jīng)比對(duì)與基因庫(kù)公布的基因大小相同，見圖1。

2.2 質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）單酶切鑒定 鑒定結(jié)果顯示出現(xiàn)大小約5 400bp條帶，與預(yù)期相符，見圖2。

圖1 PCR擴(kuò)增的Cx43

圖2 質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）的單酶切鑒定

2.3 pcDNA3.1／Cx43重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定 用NheⅠ、KpnⅠ雙酶切pcDNA3.1／Cx43重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定，單酶切重組質(zhì)粒大小約6 000bp，而雙酶切后出現(xiàn)1條大小約5 000bp及1條大小約1 000bp條帶，且雙酶切后出現(xiàn)的大小約1 000bp條帶與重組質(zhì)粒目的基因Cx43的PCR結(jié)果在同一水平線上，其大小與基因庫(kù)所提供的基本符合，酶切重組質(zhì)粒酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相同，見圖3。

2.4 pcDNA3.1／Cx43重組質(zhì)粒測(cè)序報(bào)告 結(jié)果顯示與基因庫(kù)序列一致。序列如下（斜體為Cx43cDNA全序列）：AGC AGA GCT CTC TGG CTA CTA GAG AAC CCA CTG CTT ACT GGC TTA TCG AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCC AAG CTG GCT AGC ATG GGT GAC TGG AGC GCC TTA GGC AAA CTC CTT GAC AAG GTT CAA GCC TAC TCA ACT GCT GGA GGG AAG GTG TGG CTG TCA GTA CTT TTC ATT TTC CGA ATC CTG CTG CTG GGG ACA GCG GTT GAG TCA GCC TGG GGA GAT GAG CAG TCT GCC TTT CGT TGT AAC ACT CAG CAA CCT GGT TGT GAA AAT GTC TGC TAT GAC AAG TCT TTC CCA ATC TCT CAT GTG CGC TTC TGG GTC CTG CAG ATC ATA TTT GTG TCT GTA CCC ACA CTC TTG TAC CTG GCT CAT GTG TTC TAT GTG ATG CGA AGG GAA GAG AAA CTG AAC AAG AAA GAG GAA GAA CTC AAG GTT GCC CAA ACT GAT GGT GTC AAT GTG GAC ATG CAC TTG AAG CAG ATT GAG ATA AAG AAG TTC AAG TAC GGT ATT GAA GAG CAT GGT AAG GTG AAA ATG CGA GGG GGG TTG CTG CGA ACC TAC ATC ATC AGT ATC CTC TTC AAG TCT ATC TTT GAG GTG GCC TTC TTG CTG ATC CAG TGG TAC ATC TAT GGA TTC AGC TTG AGT GCT GTT TAC ACT TGC AAA AGA GAT CCC TGC CCA CAT CAG GTG GAC TGT TTC CTC TCT CGC CCC ACG GAG AAA ACC ATC TTC ATC ATC TTC ATG CTG GTG GTG TCC TTG GTG TCC CTG GCC TTG AAT ATC ATT GAA CTC TTC TAT GTT TTC TTC AAG GGC GTT AAG GAT CGG GTT AAG GGA AAG AGC GAC CCT TAC CAT GCG ACC AGT GGT GCG CTG AGC CCT GTC AAA GAC TGT GGG TCT CAA AAA TAT GCT TAT TTC AAT GGC TGC TCC TCA CCA ACC GCT CCC CTC TCG CCT ATG TCT CCT CCT GGG TAC AAG CTG GTT ACT GGC GAC AGA AAC AAT TCT TCT TGC CGC AAT TAC AAC AAG CAA GCA AGT GAG CAA AAC TGG GCT AAT TAC AGT GCA GAA CAA AAT CGA ATG GGG CAG GCG GGA AGC ACC ATC TCT AAC TCC CAT GCA CAG CCT TTT GAT TTC CCC GAT GAT AAC CAG AAT TCT AAA AAA CTA GCT GCT GGA CAT GAA TTA CAG CCA CTA GCC ATT GTG GAC CAG CGA CCT TCA AGC AGA GCC AGC AGT CGT GCC AGC AGC AGA CCT CGG CCT GAT GAC CTG GAG ATC CTG GGT ACC GAG CTC GGA TCC ACT AGT CCA GTG TGG TGG AAT TCT GCA GAT ATC CAG CAC AGT GGC GGC CGC TCG AGT CTA GAG CCC C。

圖3 pcDNA3.1／Cx43重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞中Cx43的表達(dá)水平 RTPCR結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的U251細(xì)胞中Cx43表達(dá)較低且無(wú)明顯差異，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的U251細(xì)胞則高表達(dá)Cx43，見圖4。

2.6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)水平 Weston blot結(jié)果顯示在過(guò)表達(dá)的U251細(xì)胞內(nèi)Cx43蛋白表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組，見圖5。

圖4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞中Cx43基因的表達(dá)水平

圖5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

縫隙連接蛋白是構(gòu)成縫隙連接通道的基本單位，目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的縫隙連接蛋白已有20余種［1］，其相對(duì)分子質(zhì)量為20 000～56 000，根據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量的不同分為Cx26、Cx43及Cx56等。在不同的組織中縫隙連接蛋白的表達(dá)并不相同，如在腎組織中以Cx26的表達(dá)為主，而在腦組織中則以Cx43的表達(dá)最為廣泛［2－3］。Cx43是含有1 146bp的cDNA開放讀碼框所編碼的含有382個(gè)氨基酸殘基的單肽［4］，Cx43由核糖體合成后被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，最后聚集在細(xì)胞膜上形成縫隙連接［5］，在此過(guò)程中Cx43修飾狀態(tài)及表達(dá)量的改變都會(huì)影響到縫隙連接的功能，最后導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Cx43在維持神經(jīng)系統(tǒng)正常功能中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)的改變可能與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關(guān)；有研究提示Cx43可能參與蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)生［6－7］；張永明等［8］研究發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后 Cx43的表達(dá)上升，提示其可能參與了顱腦損傷的病理形成過(guò)程，并且可能與繼發(fā)性腦損傷的加重有關(guān)；Garbelli等［9］研究表明在難治性癲癇患者的腦組織中Cx43的表達(dá)升高，提示Cx43表達(dá)的改變可能與難治性癲癇的發(fā)病有關(guān)。有研究提示Cx43也參與了其他腦血管疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，如帕金森病、腦動(dòng)脈粥樣硬化等［10－11］。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤來(lái)自神經(jīng)系統(tǒng)支持組織，屬神經(jīng)外胚葉腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的35.26%～60.96%，是顱內(nèi)腫瘤中最常見的一種［12－13］，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。人們對(duì)其發(fā)病機(jī)制存在不同看法：Ding等［14］發(fā)現(xiàn)水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）在調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲性方面發(fā)揮著重要作用，認(rèn)為AQP4可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展有著密切的聯(lián)系；Xie等［15］發(fā)現(xiàn)，在不同病理類型和分級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）mRNA的表達(dá)不同，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ級(jí)中的表達(dá)明顯低于在神經(jīng)膠質(zhì)瘤Ⅲ～Ⅳ級(jí)中的表達(dá)，因此認(rèn)為CTGF可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定作用。而近年Caltabiano等［16］的研究卻發(fā)現(xiàn)級(jí)別越高的星型神經(jīng)膠質(zhì)瘤中Cx43的表達(dá)越高，可見Cx43在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用。作者希望通過(guò)構(gòu)建重組過(guò)表達(dá)Cx43質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，改變其Cx43的表達(dá)，為下一步進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)瘤體內(nèi)的侵襲性研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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