hfgl2凝血酶原酶基因5′端調控序列的克隆及生物信息學分析＊

李學軍，張 灝，李永敢，孫碧紅

（1.廣西壯族自治區人民醫院血液科，南寧530021；2.哈爾濱血液病腫瘤研究所血液科 150010）

人纖維蛋白原樣蛋白2（human fibrinogen－like protein 2，hfgl2）凝血酶原酶是新近發現的一種促凝因子，它可直接激活凝血酶原啟動凝血過程，在功能上相當于因子Ⅹa的作用。研究發現hfgl2凝血酶原酶與機體的一些病理過程有關，如習慣性流產、暴發性肝衰竭及移植排斥反應等［1－4］。最近的研究表明，hfgl2凝血酶原酶的激活參與慢性阻塞性肺病的發生［5］。hfgl2凝血酶原酶可能參與記憶T細胞通過腸道的外滲或遷徙，并介導T細胞對靶細胞的細胞毒作用，通過多種機制進行免疫調節［6－8］。因此，對hfgl2凝血酶原酶基因的深入研究，有助于進一步了解相關疾病的病理生理機制。基因的異常調控常常導致基因在疾病相關細胞中的表達異常，引起相應的病理生理改變，目前對hfgl2凝血酶原酶基因的表達調控機制的研究尚不深入。本研究采用生物信息學軟件初步預測了hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動子序列可能的轉錄調控位點，并以螢火蟲熒光素酶報告基因質粒為載體構建了相應基因序列的報告基因質粒，以進一步研究hfgl2凝血酶原酶基因轉錄調控機制。

1 材料與方法

1.1 質粒與試劑 螢火蟲熒光素酶報告基因載體pGL3－Basic、菌株E.coli DH5α、限制性內切酶KpnⅠ和HindⅢ購自美國Promega公司；LA Taq酶及相關聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑、DNA提取試劑盒、DNA連接試劑盒購自日本TaKaRa公司；DNA純化試劑盒、質粒抽提試劑盒購自美國Omega公司。

1.2 序列分析與結構預測

1.2.1 hfgl2凝血酶原酶基因序列的獲得 以human fgl2為關鍵詞，搜索美國國立生物技術信息中心核酸數據庫，獲得hfgl2凝血酶原酶全長mRNA序列。以hfgl2全長mRNA序列進行基本局部對比排列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析，獲取人基因組與其同源的基因序列。取基因組序列中包括第一外顯子部分序列在內的1 550bp（轉錄起始點上游1 464bp至下游86bp）的hfgl2凝血酶原酶基因5′端調控區序列進行序列分析和結構預測。

1.2.2 hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動子序列的預測 登陸http：／／rulai.csh1.org／tool／FirstEF／及 http：／／www.fruitfly.org／seq＿tools／promoter.html，利用在線分析軟件對hfgl2凝血酶原酶基因5′端調控區序列中可能的啟動子進行預測。

1.2.3 胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸（cytosine guanine dinucleotides，CpG）島預測 登陸http：／／www.ebi.ac.uk／emboss／cpgplot／，利用在線分析軟件 EMBOSS（CpGPlot／CpGReport／Isochore）對hfgl2凝血酶原酶基因5′端調控區序列中可能的CpG島位置進行預測。

1.2.4 hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動子序列順式作用元件的預測 登陸http：／／www.cbrc.jp／research／db／TFSEARCH.html，利用在線分析軟件TFSEARCH對hfgl2凝血酶原酶基因5′端側翼非翻譯區（5′untranslated regions，5－UTR）基因序列的轉錄因子結合位點進行預測。

1.3 hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動子序列質粒的構建

1.3.1 引物設計與合成 根據hfgl2凝血酶原酶基因－1 464～＋86區域的核苷酸序列，設計擴增該序列的PCR引物。上游引物引入一KpnⅠ酶切位點：5′－GAG GGT ACC CAC GAG GTT CAA ACG TAC TG－3′，下 游 引 物 引 入 一HindⅢ酶切位點：5′－GCA AGC TTC TCT GTT TCA TTG TTT GCC A－3′。引物由TaKaRa公司合成。

1.3.2 質粒的構建 按常規方法分離外周血單個核細胞，應用DNA提取試劑盒參照說明提取細胞基因組DNA，以此DNA為模板，采用LATaq酶擴增相應DNA片段。PCR條件為：95℃預變性5min后加入0.5ULA Taq酶；94℃變性1min，60℃退火1.3min，72℃延伸2min，共30個循環，最后1個循環延伸5min。取5μL PCR產物于1%的瓊脂糖凝膠上電泳，觀察反應結果。KpnⅠ和HindⅢ雙酶切PCR產物及載體pGI3－Basic，回收純化后，將PCR產物與載體大片段進行連接反應，將得到的質粒命名為pGL3－hfgl2。所構建質粒采用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，將含有酶切鑒定正確的E.coli DH5α送交TaKaRa公司測序。

2 結 果

2.1 hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動子序列的預測 經過分析，hfgl2凝血酶原酶基因5′端調控區序列中可能存在2處啟動子序列，結果見表1。

表1 hfgl2凝血酶原酶基因5′端調控區序列啟動子序列及位置

2.2 hfgl2凝血酶原酶基因的CpG島預測結果 在線分析軟件EMBOSS（CpGPlot／CpGReport／Isochore）在hfgl2凝血酶原酶基因5′端調控區序列中未發現CpG島。

2.3 hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動子序列順式作用元件的預測 設定閾值大于90分，顯示在hfgl2凝血酶原酶基因－1 464～＋84區域共有138個、31種轉錄因子結合位點，其中具有高閾值的轉錄因子結合位點包括加帽位點（CAP site）、熱休克轉錄因子（heat shock transcription factor，HSF）、尾側型同源轉錄因子A（caudal type homeobox transcription factor A，CdxA）、應激反應元件（stress response element，STRE）、Y染色體性別決定區（sex－determining region of Y－chromosome，SRY）、腈 水 解 酶 家 族 成 員 2（nitrilase family，member 2，NIT2）、deltaE、GATA－2、激活蛋白－1（activating protein－1，AP－1）、輔助轉錄因子p300以及乙醇脫氫酶基因調節因子 （alcohol dehydrogenase gene regulator 1，ADR1）。其中閾值為99分的轉錄因子結合位點見表2。

表2 閾值為99分的轉錄因子結合位點

圖1 hfgl2凝血酶原酶基因5′端調控區序列PCR擴增電泳圖

圖2 hfgl2凝血酶原酶基因5′端調控區序列質粒酶切圖

2.4 重組質粒的克隆與鑒定 以HL－60細胞基因組DNA為模板，PCR擴增獲得長度為1 567bp的hfgl2凝血酶原酶基因－1 464～＋84序列，與設計長度一致，結果見圖1。將PCR擴增基因片段插入pGL3－Basic載體得到重組質粒pGL3－hfgl2，用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切質粒得到1 560bp大小的DNA片段，與設計的插入序列大小一致，結果見圖2。測序結果顯示各插入片段與GenBank公布的序列完全一致，見圖3。

圖3 重組質粒pGL3－hfgl2的部分測序圖

3 討 論

基因表達是指基因在生物體內的轉錄、剪接、翻譯以及轉變成具有生物活性的蛋白質分子之前的所有加工過程，轉錄是基因表達的第一步。轉錄調控因子，也稱為反式作用因子，有序地結合在特定基因5′端側翼調控序列特殊位點，啟動基因的轉錄和控制基因的轉錄效率，這些位點即轉錄因子結合位點或順式調控元件。每個轉錄因子的結合位點都有特定的結合模式，找到這些特定的序列片段對研究基因的轉錄調控有著重要意義［9］。

腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF－α）、干擾素α（interferonα，IFN－α）等輔助性 T 細胞（helper T cell，Th）1型細胞因子與小鼠及人類自發性流產密切相關，二者單獨或聯合應用都可誘發小鼠的流產，細胞因子通過觸發炎癥／血栓形成過程導致流產的發生，推測在人類自發性流產中也存在相同的機制［1，10－12］。在同種異體移植所引起的急性排斥反應中，細胞因子通過激活fgl2凝血酶原酶而介導內皮細胞的損傷，使內皮細胞損傷－凝血－炎癥反應－內皮損傷的惡性病理循環發生，導致移植排斥反應［3］。這些細胞因子通過胞膜或細胞內受體經細胞內信號轉導系統轉換，改變靶基因的轉錄活性，誘發細胞特定的應答反應。而細胞內受體分布于細胞質或細胞核內，本質上都是配體調控的轉錄因子，均在細胞核內啟動信號轉導并影響基因轉錄。

hfgl2凝血酶原酶基因定位在染色體7q11.23，全長約7kb，有2個外顯子，中間有1個長度約2.2kb的內含子。hfgl2凝血酶原酶有2種mRNA轉錄本，長度分別為4.4kb和1.5kb，其cDNA全長為1 320bp，編碼的蛋白質由439個氨基酸組成。通過對鼠血管內皮細胞fgl2凝血酶原酶啟動子活性的研究顯示，fgl2凝血酶原酶的表達受其近側啟動子序列中的順式元件調控，在多個反式因子的協同作用下，共同調節內皮細胞的基礎表達和對病毒誘導的反應［13－14］，其基因5′端調控區存在的正性調控結構域（positive regulatory domain，PRD）與轉錄密切相關，PRD位于起始位點－87～－39位堿基，研究表明在PRD形成的核蛋白復合物包括特異蛋白（specificity protein，Sp）1／Sp3家族成員、八聚體結合轉錄因子（octamerbinding transcription factor－1，Oct－1）和 E26轉錄因子－1（E26 transformation－specific－1，Ets－1）等［15］。本 研 究 顯 示，hfgl2 凝血酶原酶基因5′調控區序列中可能存在2處啟動子序列，分別位于－670～－621和－72～－23位堿基。在hfgl2凝血酶原酶基因－1 464～＋84區域共有138個、31種轉錄因子結合位點，究竟哪個啟動子序列在轉錄調控中發揮主導作用以及轉錄因子對啟動子有何影響尚有待進一步研究。

CpG島是基因組中長度為300～3 000bp的富含CpG二核苷酸的一些區域，主要位于基因的啟動子和第一外顯子區域，常出現在真核生物看家基因（house－keeping gene）的調控區，約有60%以上基因的啟動子含有CpG島。啟動子區中CpG島的未甲基化狀態是基因轉錄所必需的，而CpG序列中胞嘧啶的甲基化可導致基因轉錄被抑制。本研究通過在線軟件分析hfgl2凝血酶原酶基因5′端側翼調控序列，所分析的區域無CpG島存在，表明該基因的調控可能不受CpG島的甲基化影響［5］。

雙熒光素酶報告系統是用以研究基因轉錄活性的，熒光素酶報告基因載體用螢火蟲熒光素酶基因作為報告基因，可對啟動子及增強子序列作快速及方便的分析，熒光素酶報告基因載體轉染到細胞中，可用熒光素酶檢測系統靈敏方便地測定熒光素酶基因的表達，pGL3載體含猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）啟動子及增強子的不同組合，有助于分析DNA片段的轉錄活性。本實驗成功構建了hfgl2凝血酶原酶基因近端啟動子轉錄調控序列熒光素酶報告基因表達載體，為研究該基因5′端側翼調控序列的各段DNA的調控活性奠定了基礎。

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