棘球蚴感染的檢測(cè)分析

付麗琴，趙海龍，李雪梅

（1.青海省西寧市城東區(qū)疾病預(yù)防控制中心 810000；2.青海大學(xué)，西寧 810001；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧 810001）

棘球蚴病又稱包蟲病，囊型棘球蚴病（cystic echinococcosis，CE）及泡狀棘球蚴病（alveolar echinococcosis，AE）是分別由細(xì)粒棘球絳蟲（echinococcus granulosus，EG）的幼蟲及多房棘球絳蟲（echinococcus multilocularis，EM）的續(xù)絳期幼蟲寄生于人體引起的嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病［1］。棘球蚴病免疫診斷的發(fā)展主要體現(xiàn)在特異性抗原方面，特異性抗原的確定對(duì)于提高免疫診斷方法的敏感性和特異性極為關(guān)鍵［2］。其中，抗原B（antigen B，AgB）在細(xì)粒棘球蚴囊液中含量豐富，并被認(rèn)為是目前用于免疫診斷試驗(yàn)中具有較高敏感性和特異性的抗原之一。本文探討了動(dòng)物棘球蚴感染AgB的檢測(cè)診斷意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 泡狀棘球蚴病羊感染血清100份及囊型棘球蚴病羊感染血清100份均源自中國(guó)疾病預(yù)防控制基礎(chǔ)研究所。

1.2 AgB的原核表達(dá) 從GenBank中獲得AgB1（參考序列Z26336）和AgB2（參考序列U15001）2個(gè)亞單位的完整基因序列，設(shè)計(jì)引物中包含的酶切位點(diǎn)使2個(gè)基因片段可進(jìn)行銜接。原核表達(dá)的具體步驟見參考文獻(xiàn)［2］，包括基因表達(dá)、載體構(gòu)建、載體轉(zhuǎn)移、蛋白誘導(dǎo)與表達(dá)。

1.3 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE） 使用Bio－Rad公司生產(chǎn)的Mini Protean－Ⅲ型電泳系統(tǒng)，不連續(xù)緩沖體系進(jìn)行SDS－PAGE，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為14%。凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色，Marker為Pharmacia公司產(chǎn)品。上樣樣本為泡狀棘球蚴病羊血清、囊型棘球蚴病羊血清。配置好分離膠后，用移液槍將其注入2層玻璃板間，用雙蒸水封膠，以保證制好的分離膠平整，在室溫條件下聚合40min。待分離膠凝固以后，傾去表面的雙蒸水，吸水紙吸干。配制濃縮膠，灌入分離膠上方，插入梳子，在室溫下聚合40min。濃縮膠凝固后小心拔出梳子，保證點(diǎn)樣孔平整，若有堵塞現(xiàn)象，可用針頭疏通。倒入SDS電極緩沖液，使其漫過(guò)前端玻璃板，再用針管吸去表面的泡沫。用微量加樣器吸取蛋白質(zhì)樣品上清液20μL加入加樣孔。電泳溫度為4℃左右，先將電壓穩(wěn)定在120V，當(dāng)溴酚蘭指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓加至150V，整個(gè)電泳時(shí)間為4h。電泳結(jié)束后先關(guān)閉電泳儀，將電泳槽內(nèi)的電極緩沖液倒出，取下電泳板，小心將玻璃板間的膠片取出，用10%氯乙酸固定膠片，固定一夜后進(jìn)行染色，染色30min，用清水沖洗1～2次，用脫色液進(jìn)行脫色。待背景顏色脫去或變淡后進(jìn)行照相。結(jié)果顯示上述樣品的蛋白檢測(cè)均符合標(biāo)準(zhǔn)，見圖1。

1.4 血清學(xué)評(píng)價(jià) 血清學(xué)評(píng)價(jià)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）方法，以多份泡狀棘球蚴病、囊型棘球蚴病和健康羊血清等量混合，分別配制成泡狀棘球蚴病、囊型棘球蚴病陽(yáng)性和健康羊混合血清，作為對(duì)照血清。抗原保存液按倍比稀釋后包被，做單向滴定試驗(yàn)，確定抗原的工作濃度分別為囊液粗抗原（對(duì)照）10μg／mL、重組抗原 AgB1 0.5μg／mL、聯(lián)合重組抗原 AgBs（包括 AgB1和AgB2）0.5μg／mL。待檢血清1∶100稀釋，抗人IgG辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物工作濃度1∶25 000。堿性磷酸酶底物顯色，測(cè)光密度值。以血清陽(yáng)性對(duì)照（positive，P）和陰性對(duì)照（negative，N）的吸光度值之比（P／N）≥2.5作為陽(yáng)性臨界值。

圖1 AgB原核表達(dá)的SDS－PAGE電泳

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同抗原檢測(cè)血清計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

結(jié)果顯示聯(lián)合表達(dá)抗原AgBs對(duì)囊型棘球蚴病羊血清的敏感性和特異性均為90.0%，明顯高于AgB1對(duì)囊型棘球蚴病羊血清的敏感性和特異性（分別為70.0%、56.0%）（P＜0.05），見表1。

表1 AgB1與AgBs檢測(cè)囊型棘球蚴病及泡狀棘球蚴病羊血清的敏感性和特異性分析

3 討 論

動(dòng)物患棘球蚴病后，由于包囊生長(zhǎng)緩慢，通常無(wú)明顯癥狀。50%的棘球蚴病動(dòng)物無(wú)臨床癥狀，而是因其他疾病進(jìn)行檢查時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)［3－4］。隨著科技的發(fā)展，診斷儀器的不斷進(jìn)步，應(yīng)用超聲波探查、核素掃描、CT掃描及核磁共振成像等物理診斷方法，能對(duì)病變部位、大小和物理性狀等做出較為明確的判斷，但在一些非典型影像的病例中通常對(duì)于病變性質(zhì)難以做出準(zhǔn)確的判斷［4－6］。

分子生物學(xué)工具主要用于從手術(shù)切除或活組織檢測(cè)樣本中對(duì)寄生蟲的鑒定，也用于化療或其他治療后對(duì)寄生蟲樣本活力的評(píng)估［7－9］。有研究將來(lái)源于pAL1探針序列的3個(gè)引物BG1、BG2、BG3用PCR擴(kuò)增，其中BG1／BG2引物對(duì)擴(kuò)增出多房棘球蚴種特異性的2.6kb產(chǎn)物，BG1／BG3引物對(duì)擴(kuò)增出多房棘球蚴種特異性的0.3kb產(chǎn)物。這些引物已用于不同中間宿主（包括嚙齒類和人類）病變肝臟多房棘球蚴DNA的檢測(cè)。PCR不僅用于檢測(cè)寄生蟲，還用來(lái)測(cè)定寄生蟲活力和抗寄生蟲治療的效果評(píng)價(jià)［10－11］。有研究選擇EM 10基因的種特異性引物用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase－polymerase chain reaction，RT－PCR）檢測(cè)肝穿刺物中微量的mRNA。RTPCR陽(yáng)性提示續(xù)絳期蟲體有活力，抗寄生蟲治療失敗；但RTPCR陰性并不能證明其有效，因?yàn)榛顧z樣本不可能代表整個(gè)病灶，而泡狀棘球蚴病病變組織具有活性區(qū)、壞死區(qū)和退行性變性區(qū)等不均一的組織結(jié)構(gòu)［12－13］。

免疫學(xué)診斷對(duì)輔助臨床確診是必要的，同時(shí)在棘球蚴病的流行病學(xué)調(diào)查中，免疫學(xué)診斷也具有不可替代的特殊作用［14－15］。20世紀(jì)20年代首次將包囊液抗原皮內(nèi)注射引起速發(fā)型超敏反應(yīng)用于動(dòng)物棘球蚴病診斷以來(lái)，已應(yīng)用于棘球蚴病診斷的方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接凝集試驗(yàn)、間接抗體標(biāo)記試驗(yàn)及沉淀試驗(yàn)等。不同的試驗(yàn)方法之間在診斷敏感性和特異性上存在很大的差異［16－17］。傳統(tǒng)的棘球蚴病免疫診斷試驗(yàn)通常是以蟲體抗原為基礎(chǔ)，包括包囊液和原頭節(jié)提取物，其中包囊液的2個(gè)主要抗原成分——A95和AgB，與動(dòng)物棘球蚴病的診斷密切相關(guān)。AgB是相對(duì)分子質(zhì)量約為120×103～160×103的熱穩(wěn)定脂蛋白，是由相對(duì)分子質(zhì)量約為8×103的最小亞單位組成的規(guī)律的空間組合，AgB降解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量呈漸進(jìn)性遞增，分別為8×103、16×103、24×103、32×103。由于AgB組成的復(fù)雜性，不同研究報(bào)告的來(lái)源于細(xì)粒棘球蚴囊液的天然粗抗原或純化AgB在診斷敏感性和特異性存在較大差異。分別用青海和新疆綿羊肝細(xì)粒棘球蚴的囊液粗抗原檢測(cè)青海省流行病學(xué)調(diào)查中確診的206份棘球蚴病人血清，結(jié)果青海抗原的敏感性為90.4%，新疆抗原為75.9%，兩者有顯著差異。本文結(jié)果顯示聯(lián)合表達(dá)抗原AgBs對(duì)囊型棘球蚴病羊血清的敏感性和特異性均為90.0%，明顯高于AgB1對(duì)囊型棘球蚴病羊血清的敏感性和特異性（分別為70.0%、56.0%）（P＜0.05）。

總之，AgB是目前公認(rèn)在囊型棘球蚴病與泡狀棘球蚴病診斷中特異性較好的抗原，但是聯(lián)合表達(dá)抗原AgBs對(duì)囊型棘球蚴病的診斷價(jià)值優(yōu)于單基因表達(dá)抗原AgB1。

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