嗜酸乳桿菌細菌素的分離純化及表面活性劑對其活性的影響1）

張帥，王金鳳，馬永強

（哈爾濱商業大學 食品工程學院，哈爾濱150076）

細菌素（bacteriocin）是由細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，主要含有具生物活性的蛋白質部分，對同種近緣菌株呈現狹窄的活性抑制譜［1］。由于細菌素可被人體消化道中的一些蛋白酶（如胰蛋白酶）所降解，不會在體內蓄積而引起不良作用。而且其具有熱穩定性，并耐酸、耐低溫貯藏［2］；對食品的口感、味等無不良影響；它的使用可以減弱殺菌強度，減少殺菌時間，有利于保持食品原有的營養價值和風味。

隨著社會進步和全民食品健康、安全意識的增強，廣大消費者越來越關心食品的安全性問題。在歐洲、日本等國家微生態制劑，引起高效性和安全性受到廣泛矚目。科學工作者已就細菌素的穩定性及生理生化等方面進行了較為深入的研究。研究結果顯示，細菌素不但具有抗細菌、抗真菌的作用，還具有抗寄生蟲等方面的功能，在食品保鮮方面，可望成為替代某些化學合成抑菌劑的物質［3］。

嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）是天然存在于人和動物的胃腸道的益生菌，屬于乳桿菌科乳桿菌屬（Lactobacillus），對維持胃腸道的生理功能有重要作用［4］。通過對嗜酸乳桿菌中細菌素的分離純化的研究，為食品的保鮮材料提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

嗜酸乳桿菌（L.acidophilus，分離自開菲爾粒）

指示菌株：德氏乳桿菌（L.delbrueckiisubsp.lac－tis，DSM 20076，S＋）

本研究使用的凍藏菌株使用前活化2次，使用MRS肉湯培養基（接種量2%），37℃培養24h。

瓊脂平板培養基：瓊脂粉1.5%（w／v）。

軟瓊脂培養基：向肉湯培養基中加入瓊脂粉0.75%（w／v）。

產細菌素培養基：MRS肉湯培養基配方中用油酸替代 Tween 80，油酸用量為0.1%（v／v）。

1.2 實驗儀器

恒溫培養箱，1L磁力攪拌玻璃發酵罐，大容量低溫離心機，層析柱，自動部分收集器，紫外檢測器，0.45μm醋酸纖維素濾膜。

1.3 實驗方法

1.3.1 嗜酸乳桿菌的培養

1.3.1.1 生長曲線與細菌素活力曲線

嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）首先被活化2次，然后分別在MRS和產細菌素培養基中培養。向1L液體發酵罐中加入750mL需要的培養基，接種量2%，培養溫度37℃，振蕩速率150r／min。體系pH通過pH控制裝置流加12%氨水來使之恒定為pH6.0。每次取10mL樣品進行分析，根據24h內的不同培養時間對細胞數（菌液的OD值）和細菌素活性作圖。

1.3.1.2 細菌素的發酵

L.acidophilus首先被活化2次，然后分別在MRS和產細菌素培養基中培養。向1L液體發酵罐中加入750mL需要的培養基，接種量2%，培養溫度37℃，振蕩速率150r／min。體系pH通過pH控制裝置流加12%氨水來使之恒定為pH6.0。培養16h后，用鹽酸調節培養基pH5.0，然后離心除去細胞（4000×g，10min），上清液冷藏于－20℃，以備細菌素檢測和分離純化［5］。

1.3.2 細菌素活性檢測

培養液的細菌素活性檢測采用抑菌圈法，MRS瓊脂培養基，德氏乳桿菌（L.delbrueckii）為指示菌株。

指示菌株制備：向5mL軟MRS瓊脂培養基中加入經10倍稀釋，并放置過夜的指示菌L.delbrueckii培養液0.125mL。試管內容物混合均勻，傾倒在預先鋪好的MRS瓊脂平板上。細菌素樣品使之通過0.45μm醋酸纖維素濾膜達到滅菌作用。

活性的測定采用臨界稀釋法，通過連續兩倍稀釋的培養液來檢驗指示菌的生長狀況。活性通過能產生明顯透明區的最大稀釋度的倒數來表示，活性單位（AU）每毫升培養液。測定結果通過下式計算：C＝（1000／d）×D，C是細菌素溶液濃度 AU／mL，D是稀釋倍數，d是試樣量（即每點取用的細菌素溶液量）。

1.3.3 細菌素的鹽析分離

嗜酸乳桿菌在pH6.0的產細菌素培養基中恒溫培養，離心分離細胞，上清液在4℃下用新華一號濾紙過濾，以使油酸與細菌素分離。存在于上清液相中的細菌素采用硫酸銨鹽析法（400g／L）粗分離，硫酸銨與上清液混合物在4℃下冰箱內靜置過夜，離心（8000×g，30min）分離沉淀物。收集的沉淀物然后再復溶于0.05M醋酸鈉緩沖液（pH5.0）中，4℃下用截留分子量為1kDa的膜對相同的緩沖液透析過夜，得組分Ⅰ。

1.3.4 細菌素的純化

采用 carboxymethyl（CM）－Sepharose 柱 （2cm×8.5cm），用0.05MpH5.0乙酸鈉緩沖液平衡，平衡液流速1mL／min。待組分Ⅰ上樣后，用0.073M pH5.0乙酸鈉緩沖液洗脫，至在280nm波長處無吸收檢出。

細菌素的純化采用梯度洗脫（0.073MpH5.0乙酸鈉緩沖液中溶有0～0.6MNaCl）。取3mL洗脫組分進行抗微生物檢驗。收集具有活性的組分，對20mM磷酸鈉緩沖液（pH5.8）透析得組分Ⅱ。

向組分Ⅱ中加入硫酸銨，至終濃度達10%，隨后用為含10% 硫酸銨20mM磷酸鈉緩沖液（pH5.8）平衡的octyl－Sepharose CL－4B柱（1cm×6.5cm）進行分離。用平衡緩沖液洗后，細菌素用含20mM磷酸鈉緩沖液（pH5.8）的50%乙醇洗脫。收集具有活性的組分，冷凍干燥得組分Ⅲ。

1.3.5 表面活性劑對細菌素活性的影響

在細菌素發酵過程中，向培養基中加入下列表面活性劑：吐溫Tween 20，Tween 80，Triton X－100，乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P－40），SDS，尿素，溴化十六烷基－三甲基胺 （hexadecyl－trimethylammonium bromide），N－月桂酰肌氨酸（N－lauroylsarcosine）和β－巰基乙醇（β－mercaptoethanol），所有的表面活性劑的最后濃度均為1%。為了減少二硫鍵還原對細菌素活性的影響，細菌素檢驗中加入二硫蘇糖醇（DTT，終濃度1mM）。對照由細菌素和表面活性劑及50mM磷酸鈉緩沖液（pH7.0）組成。所有樣品及對照均在37℃預熱6h，然后測定細菌素濃度。

為了觀察Tween 80的效果，培養過程中不加Tween 80，發酵后離心去除細胞后的培養基質經4℃過濾去除油酸后，加入Tween 80，濃度分別為0、0.05、0.10、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5（v／v）。然后樣品及對照在37℃預熱6h，然后測定細菌素活力。

2 結果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌的生長曲線與細菌素活力曲線

圖1 嗜酸乳桿菌生長曲線

圖2 細菌素活性變化曲線

由圖1和圖2可以看出，在嗜酸乳桿菌的培養過程中，在8h后，開始進入對數生長期，而在對數生長期的后期穩定期開始時，開始出現細菌素抑菌活性的高峰，具體時間是在16h左右達到最大的抑菌活性而且會持續到24h。在相關研究中，發現如果去除培養基中的Tween 80等表面活性劑或油酸，嗜酸乳桿菌的產細菌素能力會大大下降，有的研究者稱其原因是這些物質除具有乳酸菌生長促進劑的作用外，其乳化特性可能還會影響微生物細胞產生的親水性或疏水性小肽的生物活性。

2.2 細菌素的純化

表1 細菌素的純化進程表

細菌素的純化程序包括3個步驟：硫酸銨沉淀、離子交換色譜（IEC）和疏水作用色譜（HIC）。純化進程如表1。由上表可以看到該純化程序是有效的，但是在IEC和HIC之間，純化倍數較低。結合其他研究者的相關論述，該細菌素的水溶性應該是較低的，這也從另一個角度提示，Tween 80能夠促進其抑菌活性，應該與提高了其在溶液相中的分散性有關。此外有些研究者報告了采用電泳方法進行進一步分離失敗的情況，證實了其在水為媒介的緩沖液中的溶解能力極低。

2.3 表面活性劑對細菌素活性的影響

由表2的結果可以得出這樣的結論，陰離子表面活性劑如SDS，是通過與蛋白天然結構中的內部疏水區的配位作用使得蛋白結構被打開，從而影響蛋白質的立體結構。在這種情況下，加入兩種陰離子表面活性劑中的任何一種（SDS和N－月桂酰肌氨酸）都會使抑菌能力提高；非離子表面活性劑的作用則因化合物而異，Triton X－100和 Nonidet P－40可以提高其抑菌能力，而Tween20不會對抑菌作用產生影響，Tween 80甚至使抑菌能力下降；陽離子表面活性劑對抑菌活性的影響也各不相同，溴化十六烷基－三甲基胺能使抑菌能力大幅度提高，β－巰基乙醇也會使抑菌能力顯著降低，但是加入DTT和尿素卻觀察不到細菌素活性的明顯變化。DTT存在情況下對細菌素活性沒有影響這一事實說明，在其分子中不存在二硫鍵，這與某些研究者在細菌素氨基酸構造成的報告中，關于不存在胱氨酸的結論是一致的。而溴化十六烷基三甲胺陽離子的作用應該是極特殊的例證，已經不能簡單用表面活性劑的非特異性的影響來解釋了。

研究還發現Tween80使細菌素活性降低的程度是具有濃度依賴關系的。當加入的Tween80的濃度在一定范圍內提高時，細菌素的活性會進一步降低，但超過某一限值，繼續增加Tween80的濃度時，細菌素的活性卻不再繼續降低了。這一結果說明，表面活性劑不僅直接影響細菌素肽結構，當其濃度達到某一限量時也會提高檢驗菌株的抗性。

3 結論

通過嗜酸乳桿菌的發酵實驗研究表明，嗜酸乳桿菌在添加了油酸的MRS培養基中培養16h后達到產細菌素高峰；對發酵基質中的細菌素分離純化研究包括三個步驟：硫酸銨沉淀、離子交換色譜（IEC）和疏水作用色譜（HIC）。陰離子表面活性劑都會使抑菌能力提高；非離子表面活性劑的作用則因化合物而異；陽陰離子表面活性劑β－巰基乙醇也會使抑菌能力顯著降低，但是加入DTT和尿素卻觀察不到細菌素活性的明顯變化。而十六烷基溴化三甲胺陽離子的作用應該屬特殊的例證，尚有待進一步研究。Tween80使細菌素活性降低的程度是具有濃度依賴關系的。當加入的Tween80的濃度在一定范圍內提高時，細菌素的活性會進一步降低，但超過某一限值，繼續增加Tween80的濃度時，細菌素的活性卻不再繼續降低了。

［1］ 葉巍，霍貴成.乳酸菌細菌素應用研究進展［J］.乳業科學與技術，2006（2）：56－58.

［2］ 張艾青，劉書亮，敖靈.產廣譜細菌素乳酸菌的篩選和鑒定［J］.微生物學通報，2007（4）：112－120.

［3］ 石金舟，陳麗園，張明，等.1株產細菌素乳酸菌的篩選和鑒定［J］.中國微生態學雜志，2005（6）：75－79.

［4］ 張大為，呂嘉櫪.嗜酸乳桿菌WS所產細菌素生物學特性的研究［J］.食品工業科技，2005.（7）：70－71.

［5］ Deraz S，Karlsson NE，Hedstr·mM，Andersson MM，Mattiasson B.Purification and characterisation of acidocin D20079，a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus DSM 20079［J］.J Biotechnol.2005，117：343－354.