骨橋蛋白抑制FHIT表達促進結腸癌細胞增殖存活＊

骨橋蛋白抑制FHIT表達促進結腸癌細胞增殖存活＊

王 麗1，劉曉燕1，李 娟1，楊志惠2△
（瀘州醫學院:1.醫學分子生物學實驗室；2.病理學教研室，四川瀘州 646000）

目的構建骨橋蛋白（OPN）基因真核表達載體，轉染人結腸癌細胞SW480，研究其對SW480細胞增殖及生存能力的作用機制。方法構建重組表達載體pEGFP－N1／OPN，轉染人結腸癌SW480細胞。采用RT－PCR及免疫印跡法（Western blotting）分別檢測SW480細胞OPN基因及蛋白表達量；Cell Counting Kit－8（CCK－8）測定細胞增殖；軟瓊脂克隆形成實驗觀察細胞的錨定非依賴性生長能力。Western blotting檢測脆性組氨酸三聯體基因（FHIT）和蛋白激酶B（PKB／Akt）蛋白在SW480細胞中的表達。結果重組質粒pEGFP－N1／OPN轉染SW480后，OPN基因獲得很好轉錄，OPN蛋白表達增高，細胞增殖率（光吸收值）顯著高于轉染陰性組（P＜0.05），細胞軟瓊脂克隆形成速度增快，數量明顯多于對照組和空載體組（P＜0.05）；FHIT蛋白在實驗組表達降低，Akt蛋白在各組中的表達無顯著性差異。結論 OPN基因通過抑制FHIT基因表達，促進SW480細胞增殖、獨立存活能力。

骨橋蛋白質；結腸腫瘤；脆性組氨酸三聯體基因

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種磷酸化、帶負電荷、親水性的分泌型糖蛋白［1］。OPN蛋白分子結構內有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）結構域，其通過RGD序列能與多種整合素受體結合，促進細胞趨化、黏附和遷移。研究發現，乳腺癌、胃癌和肺癌等腫瘤組織OPN高表達，并且與腫瘤進展、預后相關［2－3］，但具體作用機制不明確，有待進一步研究。本研究擬構建OPN基因真核表達載體，轉染結腸癌SW480細胞株，探討OPN對結腸癌細胞增殖及存活能力的影響及機制，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SW480細胞株購自中國科學院細胞庫，E.coli TG1菌株及pEGFP－N1載體為本實驗室保存。

1.2 試劑 脂質體Lipofectamne2000、LA Taq with GC Buffer PCR試劑盒、限制性內切酶、連接酶購自Takara公司；DNA片段快速回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購于Qiagen公司；Cell Counting Kit－8（CCK－8）購自上海同仁化學研究所；OPN 鼠抗人多克隆抗體、脆性組氨酸三聯體基因（fragile histidine triad gene，FHIT）兔抗人多克隆抗體購自美國Bioworld Technology公司；蛋白激酶B（protein kinase B，PKB／Akt）兔抗人多克隆抗體購自上海康成生物工程有限公司；β－actin兔抗人多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；其他所用試劑均為國產或進口分析純。

1.3 方法

1.3.1 重組表達載體pEGFP－N1／OPN的構建與鑒定

1.3.1.1 OPN基因的擴增 提取結腸癌細胞株HCT116總RNA，按說明書合成cDNA。根據OPN序列NM＿001040060設計引物，上游添加XhoⅠ酶切位點，下游添加BamHⅠ酶切位點，引物序列為F:ACC TCG AGG CCA TGA GAA TTG CAG TGA TTT G，R:TAG GAT CCC GAT TGA CCT CAG AAG ATG CAC T，產物長度為863bp。

1.3.1.2 OPN基因的克隆與測序 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收863bp處DNA帶，與7Z載體連接，轉化TG1感受態細胞，篩選白斑，提取質粒，菌落PCR鑒定及BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后，陽性克隆送上海生物工程有限公司測序。

1.3.1.3 重組表達載體pEGFP－N1／OPN的構建與鑒定 用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切7Z／OPN，酶切產物與同樣的酶雙酶切的克隆載體pEGFP－N1連接，構建重組表達載體pEGFPN1／OPN，轉化E.coli TG1。篩選重組質粒的轉化子并提取重組質粒，PCR和酶切鑒定后，陽性克隆送上海生物工程有限公司進行序列分析。

1.3.2 pEGFP－N1／OPN質粒轉染人結腸癌SW480細胞株以含10%胎牛血清的L－15培養液，在37℃5%的CO2培養箱中培養人結腸癌SW480株，轉染前1天以3×105密度接種對數期SW480于6孔培養板中，當達到90%融合時，隨機分為3組:空白組（用無菌水代替質粒），對照組（加空載體pEGFP－N1）和實驗組（pEGFP－N1／OPN）。每孔加入2mL 無血清培養基，分別配制溶液1（240μL無血清培養基及10μL lip 2 000per well，溫育5min）和溶液2（240μL無血清培養基及4 μg質粒per well），混合溶液1、2于室溫下放置20min后逐滴加入孔中，搖動培養板，輕輕混勻，在37℃、5%CO2中保溫6 h，之后更換含有血清的全培養基，在37℃、5%CO2中培養48～72h，熒光顯微鏡下檢測轉染效率。RT－PCR檢測SW480細胞轉染后OPN表達；免疫印跡法（Western blotting）檢測SW480細胞轉染后OPN蛋白表達量。

1.3.3 轉染OPN后SW480生物學功能研究

1.3.3.1 CCK－8測定細胞增殖 取對數生長期SW480細胞，以5×104密度接種于96孔培養板中，待細胞貼壁后隨機分為空白組，空載體組和實驗組，每組3復孔，按常規方式進行轉染，更換含有血清的全培養基后分別培養24、48、72h，在各對應時間點取出培養板，每孔加入10μL CCK－8，37℃下繼續孵育2h，酶聯免疫檢測儀上以450nm為檢測波長，630nm為參考波長測量各孔的吸光度值（A）。

1.3.3.2 軟瓊脂克隆形成實驗 取對數生長期SW480細胞，0.25%胰蛋白酶消化吹打成單細胞，用含20%胎牛血清的L－15培養基調整細胞密度為1×106／L。制備0.7%和1.2%的低熔點瓊脂糖液，等比例分別與2×L－15培養基混合成上層和下層，加1.5mL下層培養基于6孔板凝固后，將約2 000個細胞與1.5mL上層培養基混合，加到已凝固的底層瓊脂上，形成雙瓊脂層，置于5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養10d，倒置顯微鏡下觀察，鏡下（×40）隨機挑選10個視野計數細胞克隆數，實驗重復3次。

1.3.3.3 Western blotting檢測FHIT蛋白和 Akt蛋白 按Western blotting常規操作對3組轉染細胞行FHIT、Akt、βactin蛋白檢測，結果以累積光密度比值（FHIT IOD／β－actin IOD）表示。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，實驗計量數據以±s表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SW480細胞轉染后OPN基因及蛋白表達 轉染48h后檢測OPN基因在SW480中的表達，結果顯示，空白組和空質粒轉染組有非常微弱的目的條帶，而重組質粒pEGFP－N1／OPN轉染組可見850bp左右目的條帶，3組細胞均在263bp處出現GAPDH目的條帶，表明重組質粒pEGFP－N1／OPN轉染之后外源OPN獲得很好轉錄。轉染72h后檢測OPN基因在SW480中的表達，檢查結果顯示，SW480細胞經pEGFP－N1／OPN轉染后OPN蛋白表達增高，而空白組和空載體組OPN蛋白表達弱，表明細胞轉染成功，見圖1、2。

2.2 細胞增殖分析 CCK－8法檢測3組轉染細胞增殖情況，結果顯示，隨培養時間延長，細胞增殖活性逐漸增強，轉染pEGFP－N1／OPN質粒組與對照組和空載體組相比，任何時間段轉染細胞增殖程度均出現明顯增強，表明OPN具有促進SW480細胞增殖的作用，而對照組和空載體組間的差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

圖1 RT－PCR檢測OPN轉染SW480細胞后的表達

圖2 Western blotting檢測OPN轉染SW480細胞后的表達

2.3 軟瓊脂克隆形成實驗 本實驗發現，轉染pEGFP－N1／OPN后，SW480細胞軟瓊脂克隆形成速度增快，數量明顯多于對照組和空載體組，3組細胞每視野平均克隆個數分別為:21.00±3.16，14.40±2.30，14.60±1.14，差異有統計學意義（F＝12.74，P＜0.05）。

圖3 Western blotting檢測OPN轉染SW480細胞后FHIT和Akt蛋白的表達

2.4 Western blotting檢測FHIT蛋白和Akt蛋白 FHIT IOD／β－actin IOD在空白組、空載體組和實驗組分別為0.156±0.008、0.165±0.008、0.044±0.006，比較差異有統計學意義（F＝248.47，P＝0.000），兩兩比較顯示實驗組與空白組、空載體組均有顯著性差異，空白組和空載體組間變化不明顯（P＝0.186）；Akt蛋白在3組間的表達分別為0.022±0.004、0.024±0.003、0.024±0.002，組間差異無統計學意義（F＝0.205，P＝0.820），見圖3。

表1 CCK－8法檢測轉染對人結腸癌細胞SW480增殖的影響±s）

表1 CCK－8法檢測轉染對人結腸癌細胞SW480增殖的影響±s）

組別A450 24h 48h 72h空白組0.277±0.010 0.335±0.030 0.457±0.051空載體組 0.232±0.023 0.323±0.028 0.424±0.027實驗組 0.358±0.038 0.614±0.055 0.877±0.025 F 17.763 51.512 147.534 P 0.003 0.000 0.000

3 討 論

腫瘤的發生、發展與所處的微環境密切相關，因此細胞外基質蛋白對腫瘤的發生、發展至關重要。新近發現一些細胞外基質蛋白如OPN等，在促進腫瘤細胞生長、存活、侵襲和抗凋亡等方面都發揮著重要的作用。OPN與其受體結合后激活細胞內相應的信號通路引起相應基因表達的改變，促進腫瘤侵襲轉移［4－5］。OPN與結腸癌侵襲轉移密切相關，但OPN促進結腸癌侵襲轉移的機制仍不明確，有待進一步研究［6］。

本研究結果顯示，重組質粒pEGFP－N1／OPN轉染SW480后，OPN基因獲得很好轉錄，OPN蛋白表達增高，OPN能促進SW480細胞增殖，軟瓊脂克隆形成速度增快，數量明顯增多。為研究其分子機制，Western blotting檢測FHIT蛋白和Akt蛋白在轉染OPN后SW480細胞中的表達。結果顯示，與空白組和空載體組相比，FHIT蛋白在實驗組中表達顯著降低；而Akt蛋白在各組中的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

Akt是PI3K的主要下游效應分子之一，可通過調節包括核因子－κB在內的轉錄因子參與多種生命活動。研究表明，PI3K／Akt途徑的活化參與多種腫瘤的發生，抑制該通路可誘導細胞程序性死亡和抑制腫瘤的生長。有研究顯示，腫瘤細胞在面臨生存壓力時，OPN通過與αvβ3整合素結合，增強Akt Ser473位點的磷酸化作用，激活PI3K／Akt途徑，拮抗生存壓力，提升細胞存活能力。根據本實驗結果，OPN并沒有引起Akt蛋白表達量增加。

FHIT位于人類3號染色體短臂3p14.2。研究表明，FHIT在人類許多腫瘤組織或細胞系中呈現高頻率異常，在許多腫瘤組織或腫瘤細胞株中，FHIT基因呈現多發性、廣泛性的純合性或雜合性缺失，為多種腫瘤的候選抑制基因［7－8］。作為腫瘤抑制基因，它的缺失或失活將導致腫瘤的發展和惡性度的升高，與腫瘤的發生、發展有關。本實驗結果顯示，OPN轉染組FHIT蛋白表達降低，故推測OPN通過抑制FHIT表達而促進結腸癌細胞增殖、存活。

本研究構建真核表達載體pEGFP－N1／OPN，轉染人結腸癌SW480細胞。結果顯示OPN通過降低FHIT蛋白表達促進人結腸癌細胞SW480增殖存活能力，促進腫瘤發生、發展。

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OPN regulates the FHIT protein expression to promote the proliferation and survival of SW480＊

Wang Li1，Liu Xiaoyan1，Li Juan1，Yang Zhihui2△（
1.Medical Molecular Biology Laboratory；2.Pathology Teaching and Research Section；Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan646000，China）

ObjectiveTo construct an OPN eukaryotic expression vector，and evaluate its effects on proliferation and survival in SW480colon cancer cells in vitro，exploring the possible mechanism.MethodsOPN gene was cloned into the eukaryotic expression vector pEGFP－N1，after sequencing，the vector was then transfected into SW480cells.The OPN gene and protein expression in transfected cells were demonstrated by RT PCR and Western blotting respectively.The impact on proliferation in transfected SW480cells were investigated by CCK－8method，anchorage independent growth was measured using soft agar assay.Western blotting was used to analyzing the protein of fragile histidine triad gene（FHIT）and protein kinase B（PKB／Akt）.ResultsThe levels of OPN gene and protein in colon cancer SW480cells were distinctly increased after transfection with pEGFP－N1／OPN.The OD450 value of OPN transfection group was higher than negative control group showed by CCK－8method（P＜0.05）.They could also significantly increase anchorage independent growth in vitro.FHIT protein was significantly increased in SW480cells transfected with pEGFP－N1／OPN.ConclusionIn SW480colon cancer cells，OPN was involved in promotion proliferation and survival，by regulating the FHIT protein expression.

osteopontin；colonic neoplasms；fragile histidine triad gene

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.003

A

1671－8348（2012）34－3583－03

四川省科技廳科研項目（07JY029－134）；四川省教育廳科研項目（07ZB110）。 △

，Tel:（0830）3160331；E－mail:yzhih73＠126.com。

2012－06－13

2012－09－12）