甲狀腺癌中BRAF、RET、MEN1、FOXE1等基因相關SNP位點的篩選及臨床價值＊

朱曉娥，袁耿彪△，范永增，冉海濤，鄭元義，王志剛

（1.重慶醫科大學附屬第二醫院核醫學科 400010；2.重慶醫科大學超聲影像學研究所 400010）

甲狀腺癌中BRAF、RET、MEN1、FOXE1等基因相關SNP位點的篩選及臨床價值＊

朱曉娥1，袁耿彪1△，范永增1，冉海濤2，鄭元義2，王志剛2

（1.重慶醫科大學附屬第二醫院核醫學科 400010；2.重慶醫科大學超聲影像學研究所 400010）

目的分析甲狀腺癌（TC）BRAF、RET、MEN1、FOXE1等14個基因的80個SNP突變位點，探討TC的發病機制及潛在的臨床診斷、治療和預防干預價值。方法根據2011年12月前更新的納入標準，納入文獻77篇，篩選出14個基因共80個高信息量的SNP位點。采集8例乳頭狀甲狀腺癌（PTC）、2例濾泡狀甲狀腺癌（FTC）、1例未分化癌（pDTC），共11例腫瘤組織樣本，分別取腫瘤組織、瘤旁組織，以及甲狀腺良性腫瘤（TA）組織標本22例。采用DNA純化試劑盒提取組織DNA，80個SNP位點采用Sequenom Mass ARRAY?相對分子質量陣列技術進行序列分析，并采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗分析結果。結果（1）選擇14個基因的80個位點，除了BRAF的rs1733832位點在樣本中未檢出，其余79個位點在TC、TC癌旁組織及TA中都有表達；（2）MEN1基因的rs669976位點和FOXE1基因的rs965513位點的突變在TC和TA中的表達差異有統計學意義（P＜0.05）；（3）TP53基因的rs722494在TC及TC癌旁的表達差異有統計學意義（P＜0.05）；（4）80個SNP位點在PTC中有47.5%的位點出現融合型，2.5%的位點出現缺失；在FTC中，有7.5%的位點出現融合型，1.25%的位點出現缺失。結論TC相關14個基因對TC的發生、發展及良惡性鑒別起到重要作用，為進一步對TC復發／轉移、失分化的診斷、治療、預防干預及分子靶向抑制劑的應用提供了研究的方向和潛在的臨床診斷、治療價值。

甲狀腺腫瘤；多態性，單核苷酸；基因分型

近20年來，中國的甲狀腺癌（TC）發病率呈上升趨勢；但近幾年，隨著TC規范性診療指南的推廣與應用，降低了TC的復發／轉移率和病死率，提高了患者生存率，但對于部分的復發／轉移或者失分化的TC，目前仍未有特異性的診斷和治療手段。目前，已證明有多種癌基因、抑癌基因與TC的發生、發展密切相關，在TC細胞的惡性增殖、轉移、預后以及對放、化療的拮抗起著重要作用。因此，采用快速、高效率、高通量處理TC相關基因的多個SNP位點，有助于了解不同個體基因的表型差異，不同群體對疾病的易感性，不同病理分型對藥物的耐性以及患者對不同環境反應的差異［1］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年6月至2011年11月本院術后確診為TC的患者11例，平均年齡（50.73±8.69）歲；其中乳頭狀甲狀腺癌（PTC）8例，濾泡狀甲狀腺癌（FTC）2例，未分化癌（pDTC）1例，包括7組同一個患者的配對TC及癌旁組織，其中有4組PTC，1組pDTC，2組FTC；術后病理確診甲狀腺良性腫瘤（TA）患者22例，年齡23～80歲，平均（47.61±13.42）歲，包括18例濾泡性甲狀腺腺瘤，2例結節性甲狀腺腫，1例亞甲炎，1例甲狀腺纖維腺瘤。新鮮組織樣本采取離體后30min內速凍與液氮，48h后移入－80°冰箱中保存備用。

1.2 儀器與試劑 采用美國Promega公司DNA提取試劑盒，SNP分型檢測的主要試劑來自美國Sequenom公司的iPLEX?Gold Reagent Kit試劑盒，所有引物均在上海英駿生物公司合成，質譜檢測及分析使用Sequenom公司Mass ARRAY Analyzer Compact系統。

1.3 方法

1.3.1 組織DNA提取 采用DNA試劑盒提取組織中的DNA，用分光光度計定量，瓊脂糖凝膠電泳質檢。質檢合格的DNA將濃度調整到50ηg／μL，－20℃儲存備用。

1.3.2 引物設計 采用Sequenom公司Genotyping Tools及Mass ARRAY Assay Design軟件設計，待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物，由上海英駿生物公司合成。

1.3.3 SNP位點篩選 根據NCBI、OMIM和KEGG網站所公布的基因和SCI收錄和公開發表的文獻及納入標準，篩選出14個基因共80個高信息量的SNP位點。其中PTC:BRAF及RET 2個基因36個位點，FTC的RAS及PAX8－PPARγ2個基因7個 位點，pDTC的TP53和CTNNB1 2個基因的26個位點，及其他8個相關基因的11個位點。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗分析結果，80個SNP位點采用Sequenom Mass ARRAY?相對分子質量陣列技術進行序列分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 DNA樣本提取結果 質檢后共計11例TC及癌旁組織，其中有7組配對，4例未配對（圖1）；余22例TA質檢合格（圖2）。

2.2 80個SNP位點在TC與TA的統計學分析 80個TC相關的SNP位點，其中除了BRAF基因的rs1733832在所有病例中均未檢出外，其余79個SNP位點在TC及TA中均有突變。統計分析結果顯示，多發性內分泌瘤1型（MEN1）基因的rs669976（T＞C）與甲狀腺轉錄因子2（FOXE1）基因的rs965513（G＞A）在TC與TA間差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 MEN1基因的rs669976位點的飛行質譜圖 rs669976在縱軸質量為6215和6220的位置分別為等位位點T和C（圖3、4，橫坐標為強度，縱坐標為質量）；圖3是TC，位點C有離子峰，位點T沒有峰；圖4是TA，正好相反，位點C沒有峰，位點T出現峰。

圖1 11例TC及癌旁組織DNA電泳

2.4 79個位點在7組TC及癌旁組織中的結果 7組TC及癌旁組織包括4組PTC，其中1組有淋巴結轉移；1組pDTC，2組FTC。79個SNP位點中有4個位點在其中5組樣本的癌及癌旁組織中的基因型有顯著性差異（表1）。TP53基因的rs722494在3組PTC、2組FTC及1組pDTC的癌組織中表現為GC堿基融合；TP53基因的rs1794287在有淋巴結轉移的PTC癌組織及FTC中表現為C堿基缺失；MEN1基因的rs607969在有淋巴結轉移的PTC中表現為堿基的缺失；BRAF的rs17623382在有淋巴結轉移的PTC中表現為GT堿基的融合。

圖2 TA組織DNA電泳

圖3 rs669976在TC中的飛行質譜

圖4 rs669976在TA中的飛行質譜

表1 7組TC及癌旁組織中的4個SNP的突變情況（%）

表2 80個SNP位點在11個非配對TC樣本中的分型比例（%）

續表2 80個SNP位點在11個非配對TC樣本中的分型比例（%）

2.5 80個SNP位點在11個非配對TC中的基因分型情況本研究分別篩選了與TC相關的80個SNP位點，在PTC中有47.5%的位點出現雜合型，2.5%的位點出現缺失；在FTC中，有7.5%的位點出現雜合型，1.25%的位點出現缺失；在pDTC中有8.75%的位點出現雜合型，未見位點缺失。14個基因在PTC、FTC和pDTC的分型出現率，見表2。

3 討 論

TC起病較隱匿，生物學特征多變，故鑒別診斷困難。隨著分子生物學的發展和人類對TC發病機制認識的深入，基因片段診斷及治療逐漸成為腫瘤生物學的重要組成部分［2］。

3.1 PTC 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是生物體內重要的信號轉導系統之一，MAPK的持續磷酸化或激活對細胞轉化和腫瘤的發生至關重要，可導致PTC細胞表型改變［3］。BRAF是MARK信號通路的關鍵成分，當其發生改變時可能導致腫瘤形成［4］。RET基因屬于鈣黏著蛋白，編碼跨膜酪氨酸激酶受體，對細胞的增殖和分化起著轉換信號調節的作用。本研究中，BRAF基因的21個SNP位點不僅有單堿基型，還有雜合型，與文獻報道該基因是PTC最常見的遺傳突變相符，BRAF基因的rs17623382在TC與TA的基因分型中差異無統計學意義（P＞0.05），可能與TC的病理組織分型、基因檢測方法、病例數以及地域、民族等因素有關。目前，未見文獻報道BRAF基因分型對于PTC浸潤轉移的作用。本研究表明，rs17623382位點在有淋巴結轉移的PTC癌旁組織中有不同的基因分型，但是否可為臨床早期診斷PTC的轉移提供依據，還有待進一步的研究。Cheung等［5］研究表 明，RET 基因rs1799939位點的多態性與耐藥性有關，基因分型與TC形成的輻射劑量有關［6］。本研究發現，RET基因與TC的病理分型可能有關，如何將RET的基因分型與TC的形成機制及耐藥性結合起來，還有待研究。

3.2 FTC 由于FTC的形態、結構與生物學行為的差異，易與甲狀腺濾泡狀腺瘤鑒別混淆。FTC的發病機制尚不明確，目前，文獻主要報道了PPAR信號通路在FTC的形成機制中的作用，主要包括了RAS、PAX8－PPARG等基因。RAS基因是一種原癌基因，調控細胞外信號應答，細胞增殖、分化和凋亡過程。RAS基因家族中包括很多亞型，熱點亞型最主要在HRAS、NRAS及KRAS，他們在FTC、PTC、間變性癌和濾泡狀腺瘤中的突變率也大致相同［7］。本研究中，HRAS、NRAS、KRAS基因的位點在TC和TA中的表達差異無統計學意義（P＞0.05），可能與所選的病例太少有關；其中HRAS基因的rs12628位點的基因分型可以為TC的病理分型提供一定的臨床價值，用于早期診斷和治療。近來有研究發現，在PAX8－PPARγ陽性的FTC中，參與細胞生長、細胞代謝、血管生長、信號傳導、翻譯調控等相關的基因表達上調［8］。PAX8－PPARγ基因重排在FTC中的表達率較高，也見于小部分的TA，這種表達上的差異可能與多種因素有關［9］。本研究顯示，rs1478、rs13073869、rs3856806及rs1801282在FTC中表現為單基因型，而在PTC中有雜合型；在TC和TA中，等位位點的出現頻率差異無統計學意義（P＞0.05），可能與收集的TA大多數為濾泡性腺瘤有關，說明PAX8－PPARγ基因重排在鑒別濾泡性甲狀腺腫瘤的良、惡性上，還有待進一步研究。

3.3 pDTC TP53的突變體在不同人群的癌癥中都經常發生，但并沒有對基因的結合位點達成共識。有報道稱，p53基因突變可以加劇分化型TC向pDTC［10］。本實驗中篩選的TP53基因21個SNP位點，融合突變發生率在PTC較高，在FTC較低，在pDTC中沒有；而缺失在PTC和FTC概率一致；說明TP53的基因分型與TC的病理類型有一定的相關性，對于低分化腺癌形成機制的研究有幫助，故TP53抑癌基因可以作為分子診斷靶向工具。CDH1、CTNNB1基因都屬于鈣粘連蛋白的一種，在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中起了一定的作用。近期文獻提到了CTNNB1基因及其編碼的鈣粘連蛋白與TC之間有著密切的關系［11］。CDH1基因突變導致該基因功能的缺失，影響著腫瘤的生長增殖、浸潤和轉移［12］。實驗證實CTNNB1基因的5個位點和CDH1基因的2個位點在PTC中都有堿基的雜合型，CDH1基因在FTC僅有一個出現雜合，在pDTC均為單堿基型。說明這兩種鈣粘連蛋白基因與pDTC的形成機制有關。

3.4 其他與TC相關的基因 FOXE1基因的rs1867277是TC形成的易感因素之一，rs965513與PTC形成的放射性環境有關。本研究中，FOXE1基因的rs965513在TC及TA的基因分型差異有統計學意義（P＜0.05）。雖然文獻未報道rs1443434在TC中的作用，但本研究證實了其在PTC中出現了融合型，說明它對于TC的發生、發展起到一定作用。MEN1基因為一種新發現的抑癌基因，它的突變和缺失，導致其編碼蛋白的失活。國外文獻稱，MEN1基因與遺傳性TC的形成有一定的相關性。本研究選擇MEN1基因的rs607969位點，在有淋巴結轉移的一組PTC組織表現為堿基的缺失，而在癌旁組織中表現為堿基的雜合，是否可以用rs607969位點作為鑒別PTC浸潤轉移的手段，還有待于進一步研究。NKX2－1最初被發現也是屬于甲狀腺轉錄因子的一種，其編碼的蛋白質與甲狀腺球蛋白的啟動有關，并調節甲狀腺的生長發生和基因表達，尤其是rs944289在TC的病理分型、浸潤轉移及放射性環境的影響中的作用。

綜上所述，與TC相關的SNP，既有與TC浸潤轉移相關的，也有與TC形成的放射性環境相關的，還有與TC抗腫瘤藥物的耐藥性相關的，采取大通量、高速、快捷的篩選TC相關SNP位點的實驗技術是可行的，可以建立有效的預警系統，達到一級防預目的。

［1］朱曉娥，袁耿彪.基因芯片技術在基因突變診斷中的應用及其前景［J］.重慶醫學，2010，39（22）:3128－3131.

［2］袁耿彪.甲狀腺癌腫的基因突變及其在診斷治療中應用的研究進展［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2009，16（3）:1－5.

［3］Syvanen AC.Accessing genetic variation:genotyping single nucleotide polymorphisms［J］.Nat Rev Genet，2001，2（12）:930－942.

［4］Engelberg D.Stress－activated protein kinases－tumor suppressors or tumor initiators［J］.Semin Cancer Biol，2004，14（4）:271－282.

［5］Cheung CC，Ezzat S，Freeman JL，et al.Lmmunohistochemical diagnosis of papillary thyroid carcinoma［J］.Mod Pathol，2001，14（4）:338－342.

［6］Sigurdsona AJ，Landa CE，Bhatti P，et al.Thyroid nodules，polymorphic variants in DNA repair and RETrelated genes，and interaction with ionizing radiation exposure from nuclear tests in Kazakhstan［J］.Radiat Res，2009，171（1）:77－88.

［7］Lang BH，Lo CY，Chan WF，et al.Staging systems for follicular thyroid carcinoma:application to 171consecutive patients treated in a tertiary referral centre［J］.Endocr Relat Cancer，2007，14（11）:29－42.

［8］Kondo T，Ezzat S，Asa SL.Pathogenetic mechanisms in thyroid follicular－cell neoplasia［J］.Nat Rev Cancer，2006，6（4）:292－306.

［9］Castro P，Reboeho AP，Snares RJ，et al.PAX8－PPAR－gamma rearrangement is frequently detected in the follicular variant of papillary thyroid carcinoma［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91（1）:213－220.

［10］Kroll TG，Sarraf P，Pecciarini L，et al.PAX8－PPARgammal fusion oncogene in human thyroid carcinoma［corrected］［J］.Science，2000，289（5483）:1357－1360.

［11］Namba H，Yamashita S.Gene abnormalities in thyroid cancer［J］.Nippon Rinsho，2007，65（11）:1967－1972.

［12］Tartari CJ，Donadoni C，Manieri E，et al.Dissection of the RET／β－catenin interaction in the TPC1thyroid cancer cell line［J］.Am J Cancer Res，2011，1（6）:716－725.

Selection and clinical value of 80 SNP loci from BRAF，RET，MEN1，FOXE1，etc in thyroid neoplasms＊

Zhu Xiao′e1，Yuan Gengbiao1△，Fan Yongzeng1，Ran Haitao2，Zheng Yuanyi2，Wang Zhigang2（1.Department of the Nuclear Medicine，the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing400010，China；2.The Ultrasonic Imaging Institute of Chongqing Medical University，Chongqing400010，China）

ObjectiveTo analyze the 80SNP loci of 14genes about BRAF，RET，MEN1，FOXE1，ect，to study the pathogenesis and the clinical diognosis，treatment and prevention value of these genes in the TC.MethodsAccording to the criteria until December，2011，we selected 80high imformative SNPs loci of 14genes from 77PUBMEDS.We collected 11cases of TC（8cases of PTC，2cases of FTC and 1case of pDTC）and 22cases of TA.The DNA was extrated by DNA purification kit，the SNP loci sequence were analysed by Sequenom Mass ARRAY，the result were analysed with SPSS17.0.Results（1）We found the expression of 80 SNPs in the TC and TA，except rs 1733832of BRAF.（2）There were significant difference in the expression of rs669976of MEN1 and rs965513of FOXE1mutation between TC and TA（P＜0.05）.（3）The expression of rs722494from TP53detected significant difference between TC and TC paraneoplastic（P＜0.05）.（4）The incidence rate of the fusion type of 80SNPs were 47.5%，7.5%and 8.75%in PTC，FTC and pDTC；the incidence rate of the deletion type of 80SNPs were 2.5%and 1.25%in PTC and FTC.ConclusionWe study the important role of 80SNPs loci of TC in the pathogenesis，development and the identification of benign and malignant of TC.This conclusion provides future research direction and potential clinical diagnose and treatment value for TC relapse and metastasis，dedifferentiation diagnose，treatment，prevention intervention and the application of molecular targeted inhibitors.

thyroid neoplasms；polymorphism，single nucleotide；genotyping

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.002

A

1671－8348（2012）34－3580－03

國家自然科學基金重點資助項目（81130025）；國家自然科學基金中加資助項目（81110219）；國家自然科學基金資助項目（30900371）。 △

，Tel:023－63693339；E－mail:yuan＿gb＠126.com。

2012－06－09

2012－08－22）