啤酒酵母RNA提取條件的優化及其磁性固定化

王 紅 英, 孫 井 輝, 錢 斯 日 古 楞, 李 長 青

( 大連工業大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

RNA是生物體最重要的基因表的物質基礎,除了在生物體正常的生長外,它與生命的異常如腫瘤等有密切關系。雙鏈RNA對基因表達的阻斷被稱為RNA干預(RNA interference,RNAi)[1]。雙鏈RNA經酶切后會形成很多小片段,稱為siRNA。它與mRNA中的同源序列互補結合,會導致其對應的mRNA失去功能,使基因“沉默”,以此治療疾病[2-3]。但siRNA進入細胞后易被降解,故穩定和快速傳遞siRNA的新型給藥系統的研究較為關注[4]。以磁性微球為載體的靶向藥物能夠使藥物靶向傳遞,減輕藥物對其他部位的不良反應,同時通過磁場富集的藥物能夠提高療效。因此磁性固定化能夠使siRNA快速到達目的部位和避免運輸過程中的降解。

本研究對啤酒酵母總RNA進行提取,并對其進行磁性固定化研究,以期為磁性固定化siRNA的靶向性研究和RNAi研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

啤酒酵母(S.cerevisiae)；磁性殼聚糖微球，本實驗室自制[5]；戊二醛,天津基準化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 酵母RNA的提取

采用濃鹽法提取酵母RNA[6]。將8 g酵母加入質量分數為10%的NaCl溶液中,置于100 ℃ 水浴鍋中攪拌4 h,冷卻后在3 500 r/min條件下離心10 min。將上清液用6 mol/L鹽酸調pH至2.4,在冰浴中靜置使其完全沉淀,將所得上清液以3 500 r/min離心10 min獲得核酸沉淀物。用體積分數95%乙醇洗滌沉淀物質,去除殘余雜質及色素；沉淀再用乙醚洗滌兩次,通過布氏漏斗抽濾,冷凍干燥獲得RNA粉末。

1.2.2 定磷法測定啤酒酵母RNA質量分數

磷標準曲線制作用最小二乘法作線性回歸,得回歸方程。

Y=0.047 0X-0.002 7,R2=0.999 6

w(RNA)=10-6n(T1/m1-T2/m)(340/31)

式中,T1,總磷微克數；T2,無機磷微克數；n,稀釋倍數；m1,樣品數,μg；m,樣品質量,μg；340,RNA平均相對分子質量；31,磷的原子數。

1.2.3 磁性微球固定化RNA

準確稱取10 mg磁性殼聚糖微球,用3%的戊二醛溶液浸泡2 h,對其進行活化。再用無水乙醇和超純水對微球反復洗滌,洗去多余的戊二醛等。將活化好的微球加入到一定質量分數的RNA溶液(質量濃度為2 mg/mL),在40 ℃條件下振蕩4 h,得到磁性固定化RNA。用磁場將磁性RNA沉淀,用超純水洗滌沉淀至上清液無RNA洗出。匯集上清液,測定RNA總量。

2 結果與討論

2.1 酵母RNA提取的正交優化試驗

采用正交分析方法對濃鹽法提取酵母RNA提取影響因素進行優化,試驗設計為L9(34)正交試驗,試驗方案見表1。

表1 酵母RNA提取的正交試驗因素與水平

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment of the yeast RNA extraction

水平At/hBθ/℃Cw(NaCl)/%Dw(酵母)/%12908823951010341001212

由表2、3可見,因素A即反應時間為最顯著影響因子。最佳提取工藝為A3B3C2D1,即反應時間4 h,反應溫度100 ℃,氯化鈉質量分數10%,酵母質量分數8%，最佳提取條件下RNA的提取率可達6.13%。

表2 酵母RNA提取的正交試驗結果與分析

Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment of the yeast RNA extraction

試驗號ABCD提取率/%111114.70212225.52313336.00421234.82522315.59623126.01731324.88832135.45933216.13均值15.4074.8005.3875.473均值25.4735.5205.4905.470均值35.4876.0475.4905.423極差0.0801.2470.1030.050

表3 正交試驗方差分析表

Tab.3 Variance analysis of orthogonal experiment

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性抽提時間2.3502111.90519.000*抽提溫度0.02121.00019.000NaCl質量分數0.01120.52419.000酵母質量分數0.00520.23819.000誤差0.0202

2.2 RNA固定化條件的優化

2.2.1 固定化最佳RNA添加量

取8只100 mL三角瓶,分別加入10 mg經活化的磁性微球,再分別加入5、10、15、20、25、30、35和40 mL RNA溶液(質量濃度為2 mg/mL),40 ℃恒溫振蕩4 h,用磁鐵將磁性RNA沉淀,過濾、洗滌、收集上清液,通過定磷法測定總RNA質量分數,結果如圖1所示。由圖1可知,當RNA添加量不足30 mL時,固定化后的洗滌上清液中游離的RNA極少,說明少于30 mL 添加量的RNA完全被固定化；當RNA添加量超過30 mL時,上清液中的游離RNA量逐漸增大,說明微球表面固定化RNA達到飽和,繼續增加RNA添加量,RNA固定化率不變。綜合考慮,每10 mg磁性殼聚糖微球的最佳RNA添加量為30 mL。

2.2.2 固定化最佳反應時間

在4只100 mL三角瓶中各加入10 mg活化的磁性微球和30 mL RNA溶液,40 ℃振蕩2、4、6、8 h。將磁性微球沉淀,過濾,用純水洗滌,收集上清液和洗滌液,用定磷法測定其RNA質量分數,結果如圖2所示。由圖2可見,固定化時間2～8 h,上清液中RNA質量分數先下降(4 h達到最低)而后逐漸增大。這是因為當固定化時間小于4 h,有部分RNA和微球未很好地結合；當固定化的時間大于4 h,已被固定化的部分RNA脫落,因而上清液中RNA質量分數有所增加。因此RNA的最佳固定化時間確定為4 h。

圖1 RNA添加量對磁性固定化的影響

Fig.1 Effect of RNA addition on the magnetic immobilization

圖2 固定化時間對RNA固定化的影響

2.2.3 固定化最佳反應溫度

取4只100 mL三角瓶,各加10 mg活化的磁性微球,加入30 mL的RNA溶液,分別在20、30、40和50 ℃進行固定化4 h。用磁場將磁性微球沉淀,過濾,收集上清液和洗滌液,用定磷法測定其RNA質量分數,結果如圖3所示。

圖3 溫度對RNA固定化的影響

Fig.3 Effect of temperature on RNA immobilization

由圖3可見,隨著固定化溫度的提高,上清液中RNA質量分數逐漸降低,40 ℃時達到最低,當溫度超過40 ℃,上清液中RNA質量分數提高。因此固定化最佳反應溫度確定為40 ℃。

3 結 論

通過對RNA提取條件的優化,得到了濃鹽法提取啤酒酵母RNA的最佳工藝條件,并將提取的RNA進行磁性固定化,得到磁性固定化RNA的最佳條件。在提取時間為4 h、提取溫度100 ℃、氯化鈉質量分數10%和酵母質量分數8%的最優條件下,RNA的提取率達到6.13%,其中RNA提取時間對提取率的影響最為顯著。RNA的最佳固定化條件為,RNA的添加量30 mL(質量濃度為2 mg/mL),固定溫度40 ℃,固定化時間4 h。

本實驗對siRNA新型給藥系統的發明進行探索,為RNAi技術的應用開拓一個新的道路。

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(QIAN Si-ri-gu-leng, WANG Hong-ying. Preparation of magnetic starchy composite microspheres and its characteristics[J] . Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2003, 22(3):191-193. )

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