飼用纖維素酶檢測方法的研究

王冠徐麗丁皓程瑛

(武漢新華揚生物股份有限公司，湖北武漢 430074)

纖維素是植物細胞的主要成分，屬于一種葡聚糖天然高分子化合物，由葡萄糖分子通過β-1,4-糖苷鍵連接而成[1]，它難以被單胃動物消化，并且對飼料中各種養分的利用具有明顯的干擾和抑制作用[2]。

研究表明,向飼料中添加纖維素酶，不僅能有效地消除纖維素的抗營養作用，而且能促進飼料中各種養分的消化和吸收利用，提高飼料代謝能值和動物的生產性能，增進畜禽健康，減少畜禽排泄物對環境的污染及拓寬飼料原料應用的范圍[3]。因此，纖維素酶在飼料工業中具有廣闊的應用前景[4]。

纖維素酶（cellulase）是指能水解纖維素β-1,4-葡萄糖苷鍵使纖維素變成葡萄糖的一組酶的總稱。它不是單一酶，而是起協同作用的多組分酶系，包括：內切葡聚糖酶（EG或CX）、外切葡聚糖酶（CBH、EC 或 C1）、β-葡萄糖苷酶（CB纖維二糖酶）[5-7]，而且纖維素酶作用的底物也比較復雜，致使纖維素酶活性的測定方法很多，且復雜而不統一。

目前，飼用纖維素酶的國家檢測標準有羧甲基纖維素鈉(CMC)法(NY/T 912—2004)和濾紙法(GB/T 23881—2009)。本試驗參照標準，分析了CMC法檢測纖維素酶的適應性，并對兩種方法的測定結果進行了比較，以期為制定統一的纖維素酶活性的測定方法提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

羧甲基纖維素鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、無水亞硫酸鈉、葡萄糖、醋酸、醋酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉（上述試劑均為分析純），Whatman 1號濾紙條（1.0 cm×6.0 cm）。

纖維素酶樣品均采購于市場。

紫外-可見分光光度計（Unico UV2800）、水浴搖床、漩渦混合器、電子天平（萬分之一）、恒溫水浴鍋、移液器、秒表等。

1.2 試驗方法

纖維素酶的CMC酶活性參照標準NY/T912—2004；纖維素酶的濾紙酶活參照標準GB/T 23881—2009。

取纖維素酶樣品，根據標示酶活性，在可取值范圍內采用不同稀釋倍數對酶液進行稀釋后，分別采用CMC法和濾紙法檢測其活性，考察了CMC法的適應性，并對兩種方法的結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

CMC法檢測纖維素酶活性的標準曲線為y=1.114 7x+0.106 5（R2=0.999 5），濾紙法檢測纖維素酶活性的標準曲線為y=1.113 8x+0.104 2（R2=0.999 6），二者基本一致。CMC法和濾紙法的標準曲線使用的緩沖體系不同，CMC法采用的是0.1 M乙酸鹽緩沖液，而濾紙法采用的是0.05 M檸檬酸鹽緩沖液，pH值均為5.5，盡管兩種方法的緩沖體系不同，但對反應基本沒有影響，得到的標準曲線一致。

2.2 CMC法檢測纖維素酶活性的適應性

取不同公司的纖維素酶樣品A、B、C，參照NY/T912—2004，采用不同的稀釋倍數對酶液進行稀釋，使其吸光值都在標準曲線的可取值范圍內，測得的結果見表1。

由表1可見，隨著稀釋度的改變，測得的酶活性會隨之改變，稀釋度越大，測得的酶活性越高，反之就越低。根據CMC法的標準曲線，測得的樣品吸光值在0.1～0.8的范圍內都是有效的，但由表1的結果可知，不同的有效吸光值得到的纖維素酶CMC活性差異非常大，如：樣品A稀釋1 250倍時吸光值0.755，測得酶活性為1 097 U/g；稀釋20 000倍時吸光值為0.162，測得酶活性為5316U/g，前者酶活性僅為后者的20.6%。當然，這2個吸光值差異較大，根據NY/T 912—2004，推薦稀釋后酶液活性保持在0.04～0.08 U/ml，根據標準曲線進行換算后即為樣品吸光值在0.15～0.4范圍內較適宜，即使保證樣品吸光值在推薦的取值范圍內，測得的酶活仍然差異顯著：如樣品A稀釋20 000倍時吸光值為0.162，測得酶活性為5 316 U/g，而樣品A稀釋10 000倍時吸光值為0.289，測得酶活性為3 969 U/g，兩者差異極大。樣品B和C也是如此。

理論上講，在可取值范圍內測得的酶活性應該差異很小。出現這種情況的原因可能是纖維素酶能將羧甲基纖維素降解成寡糖和單糖，具有還原性末端的寡糖和還原基團的單糖在沸水浴條件下與DNS發生顯色反應，用標準葡萄糖溶液作標準液，通過分光光度計在540 nm處測其吸光度，以每分鐘生成相當于1 μmol的葡萄糖為一個酶活性單位。但纖維素酶包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，普遍認為以羧甲基纖維素等無定形纖維素為底物，以還原糖的生成量表征酶活性的CMC法表征的是內切葡聚糖酶的活力，俗稱CMCase或CX酶活性。

根據酶促反應動力學通則，酶活性的測定是在底物過量存在的條件下，測定酶促反應的初速度來表示酶活力。CMC法檢測纖維素酶的CX酶活性，根據NY/T 912—2004，底物濃度為 8.0 g/l，在僅檢測內切葡聚糖酶活性的情況下底物應該是過量的[8]，符合酶促反應動力學。但實際上纖維素酶是多組分酶系，各組分間有協同作用，涉及多種反饋控制機理[5-6]，理論上采用CMC法檢測內切葡聚糖酶活性，可同時，外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶也在發揮作用，導致酶促反應的模式發生改變，成為多種酶協同作用高效分解底物CMC，這種情況下原先的底物濃度就無法保證酶促反應中底物過量的原則，測得的初速度也無法真實反映纖維素酶的活性，從而導致了CMC檢測纖維素酶的試驗中出現了稀釋倍數越高測得酶活性越高的情況。實際檢測時情況就更加復雜了，不同公司的纖維素酶，來源不同，生產工藝亦不同，導致了它們的纖維素酶組成不同，協同作用的效率也不同，難以用CMC法測得的初速度來表征其纖維素酶或內切葡聚糖酶的真實活性。

那么，提高底物CMC的濃度是否能改變這一狀況？以樣品A為例，分別試驗了CMC底物濃度為16.0 g/l和24.0 g/l時不同稀釋倍數下測得的酶活性(見表2)。

表2 不同底物濃度下CMC法檢測纖維素酶活性

如表2所示，一方面，隨著底物濃度的提高，同樣稀釋倍數下測得的纖維素酶活性也有所提高，說明確實存在著底物濃度不足的問題；另一方面，盡管底物濃度提高了，可不同稀釋倍數間測得的酶活性依然存在一定的差異，不過，隨著底物濃度的增加，這種差異也越來越小。考慮到不同公司的纖維素酶樣品間存在差異，要將底物濃度提高到什么程度才能完全解決CMC法的適應性問題，還不好下定論。目前看來，要解決這個問題，首先是規定較高的底物濃度，其次是規定較窄的取值范圍，這樣可以極大地提升CMC法檢測纖維素酶活力的適應性，在目前飼用纖維素酶普遍采用CMC檢測的情況下，要規范市場秩序，促進飼用纖維素酶的良性發展。

2.3 CMC法和濾紙法檢測纖維素酶活性的比較

取不同公司的纖維素酶樣品，參照NY/T 912—2004和 GB/T 23881—2009（取值范圍均為 0.25～0.35），測得的結果見表3。

表3 CMC法和濾紙法檢測纖維素酶活性

如表3所示，不同公司的纖維素酶分別采用CMC法和濾紙法進行檢測，發現同一樣品的CMC酶活性和濾紙酶活性差異較大，而且不同樣品間的CMC酶活性和濾紙酶活性的比例也不同。

濾紙是聚合度和結晶度都居中等的纖維性材料，以其為底物經纖維素酶水解后生成還原糖的量來表征纖維素酶系總的糖化能力的方法得到廣泛應用，它反映了3類酶組分的協同作用，統稱濾紙酶活性(FPA)。而CMC法主要檢測的是纖維素酶的內切葡聚糖酶活性，因此，兩種檢測方法的結果有所不同。此外，不同公司的纖維素酶的組成不同，造成了測得CMC酶活性與濾紙酶活性的比例也有所差異。

濾紙法測定總酶活性雖然是一種通用的、公認的、經典的方法，但也受到DNS試劑的新鮮程度、沸水浴的激烈程度、濾紙單位面積大小及濾紙切割方式等因素的影響，特別是濾紙法，測得的纖維素酶活性要遠遠低于CMC酶活性，因此，盡管2009年國標濾紙法檢測纖維素酶活性早已頒布，但市場推廣率卻極其有限，目前普遍使用的仍是2004年農業部的CMC法標準，而CMC法又存在著上述適應性較差的問題，造成了質量檢驗的不便，導致市場的混亂。

3 討論與展望

本文通過對CMC法(NY/T912—2004)與濾紙法(GB/T 23881—2009)檢測纖維素酶活性的分析，發現CMC法的適應性較差，應提高底物濃度并減小樣品吸光值的取值范圍來進行改善；濾紙法測得的纖維素酶活性遠低于CMC酶活性，且不同公司的CMC酶活性與濾紙酶活性的比例不同。這是由于纖維素酶是多組分酶系，包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，各組分間有協同作用，反應過程復雜，涉及多種反饋控制機理所造成的。目前普遍接受的纖維素酶協同作用模型是：C1酶破壞纖維素的結晶結構，作用于不溶性纖維表面，使纖維素結晶鏈開裂，長鏈纖維素分子末端部分游離和暴露，使纖維素易于水化，經C1酶作用后的纖維素分子結晶結構已經被破壞，CX酶即吸附在纖維素分子上面，從鍵的內部任意位置切開β-1，4-糖苷鍵，將纖維素分子斷裂為纖維二糖和纖維三糖等。最后這些被裂解產物纖維二糖、纖維三糖和其他低分子纖維糊精由β-葡聚糖苷酶分解為葡萄糖。

纖維素酶活性的測定方法除CMC法和濾紙法外還有很多其他的方法，這就要求我們在選擇具體方法時，必須考慮測定的具體目的，根據需要選擇合適的方法[9]。

飼用纖維素酶作為綠色環保的新型飼料添加劑，在飼料工業中具有廣闊的應用前景。而利用纖維素酶將纖維素降解，對纖維素酶活性的測定方法的研究是個重點，找到簡單、快速、準確又合適的測定方法，會為纖維素酶的研究打開一扇大門，積極推進纖維素酶在各個領域的廣泛應用。

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