飼用產朊假絲酵母的發酵培養條件研究

李加友 蔡麗陽 于建興 沈 潔 陸筑鳳

(1.嘉興學院生物與化學工程學院，浙江嘉興 314001；2.嘉興市知味軒飼料有限公司，浙江嘉興 314001)

產朊假絲酵母（Candida utilis）作為 GRAS（Generally regarded as safe）生物可用于食品和藥品行業，用于食用蛋白和谷胱甘肽等產品的生產[1]。德國、美國等一些國家和地區廣泛地將產朊假絲酵母用于飼料行業，作為優良的飼用蛋白質；或者用于秸稈、菜籽餅等材料的發酵，用于飼用蛋白的生產或脫毒[2-3]。產朊假絲酵母具有較強的轉化無機氮為有機氮的能力，并且在其發酵過程中會產生大量的生物活性物質，因此，利用產朊假絲酵母生產飼用添加劑或發酵劑具有良好的應用前景。

利用單因素比較試驗和響應面分析的方法對產朊假絲酵母的發酵培養條件進行優化，為產朊假絲酵母在發酵飼料和富硒飼料產品開發中的應用奠定基礎[4-5]。

1 材料與方法

1.1 菌種

產朊假絲酵母（Candida utilis），本實驗室保藏。

1.2 培養基

菌種活化培養基和菌種保藏培養基。

麥芽汁培養基：稱取150 g麥芽，用600 ml水在65℃水浴鍋中糖化4 h。將糖化液用4～6層紗布過濾，將濾液放置在冰箱中靜置過夜。去沉淀后收集上清液，調整其波美度至 12оBe'，121 ℃滅菌 20 min，pH值自然。固體培養基另加1.5%的瓊脂。

發酵出發培養基：葡萄糖10 g/l、蛋白胨15 g/l、K2HPO41.0 g/l、MgSO41.0 g/l，pH 值 5.0。

1.3 試劑和藥品

蛋白胨和酵母膏為生化試劑，葡萄糖等其他化學試劑為分析純。

1.4 儀器設備

DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司生產）、FA1104N電子天平（上海精密科學儀器有限公司生產）、UV754紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司生產）、Qyc-211全溫空氣搖床（上海福瑪實驗設備有限公司生產）。

1.5 方法

1.5.1 培養條件的單因素優化

利用單因素比較的方法對培養條件進行優化，根據發酵出發培養基，在單因素優化試驗中，只改變其中一個待測因素，而其他條件保持不變。

1.5.2 響應面分析

根據單因素試驗確定的主要影響因素，利用Box-Behnken組合設計的方法對其進行試驗，然后利用響應面分析方法對結果進行回歸模擬，確定最優培養條件。

2 結果與分析

2.1 產朊假絲酵母發酵培養條件的單因素試驗

2.1.1 碳源對酵母菌生長的影響(見圖1)

圖1 碳源對酵母菌生長的影響

酵母生長過程中需要添加適量的速效碳源，以利于菌體對環境的快速適應而縮短延滯期。由圖1可知，當葡萄糖和蔗糖濃度均為20 g/l時，酵母的生物量達到最大值，但葡萄糖對菌體生長的促進作用明顯較蔗糖要顯著得多。酵母菌對葡萄糖的利用要更容易且更有效，但進一步增加葡萄糖濃度對酵母的生長有一定程度的抑制作用，可能的原因是高濃度葡萄糖在前期促進酵母菌快速生長后，導致體系中溶氧不足，反而對菌體的生長產生了抑制作用，也有可能是過多的葡萄糖代謝后會產生有機酸，導致體系pH值下降，不利于酵母菌的生長。因此，選用葡萄糖為酵母菌生長的碳源，且適宜濃度為20 g/l。

2.1.2 氮源對酵母菌生長的影響(見圖2、圖3)

圖2 無機氮源對酵母菌生長的影響

圖3 有機氮源對酵母菌生長的影響

酵母生長時需要添加一定量的氮源，通常合適的氮源對酵母菌的生長產生決定性的影響。試驗結果表明，無機氮源中硝酸銨對酵母菌的生長較有利，可能的原因是硝酸銨可以被酵母菌完全利用，而硫酸銨和氯化銨中的NH4+被利用后，發酵液中較高濃度的SO42-和Cl-對酵母菌的生長有一定的毒性。在以酵母膏和蛋白胨為氮源的酵母發酵過程中，酵母膏對產朊假絲酵母的生長有較好的促進作用。從圖2和圖3的比較可以看出，在酵母菌的發酵培養中，無機氮源較有機氮源的效果要差，因此，選用酵母膏為產朊假絲酵母發酵培養的氮源。

2.1.3 無機鹽對酵母菌生長的影響(見圖4)

圖4 無機鹽對酵母菌生長的影響

無機鹽是微生物生長的必需營養成分，因此，在實際發酵過程中，需要考察不同無機鹽對微生物生長的影響。通過比較K2HPO4、MgSO4、CaSO4、NaCl 和MnSO4等幾種常見和常量無機鹽對酵母菌生長的影響，選擇對酵母菌影響較為顯著的無機鹽用于進一步的優化試驗。結果表明，K2HPO4和MgSO4對酵母菌生長的影響較其他因素顯著，當MgSO4用量為1 g/l時，酵母菌的OD600達到了1.63，而當K2HPO4的用量為1.25 g/l時，酵母菌的OD600達到最大值，進一步增加他們的濃度，酵母菌生物量并不再顯著增加。在所考察的無機鹽中，K2HPO4、MgSO4對酵母菌生長影響較顯著，而且在試驗中發現，加入K2HPO4、MgSO4兩種無機鹽，對酵母菌的生長更為有利，因此，在響應面分析中，選擇這兩種無機鹽用于優化試驗。

2.1.4 pH值對酵母菌生長的影響(見圖5)

圖5 不同pH值下的產朊假絲酵母生長情況

試驗結果表明，產朊假絲酵母的最適生長pH值為5.5。不同pH值對培養基中各組分的解離、菌體細胞外周帶電性質等都會產生相應影響，也會影響胞內酶的催化活性，從而進一步影響菌體對營養物質的吸收和生長，因此，選擇合適的pH值對酵母菌的發酵培養具有重要意義。

2.1.5 溫度對酵母菌生長的影響(見圖6)

圖6 不同溫度下的產朊假絲酵母的生長曲線

由圖6可知，在25℃和28℃時，酵母菌的生長情況相似，28℃時酵母菌的生物量稍高于25℃時的生物量，到28 h時生物量達到最大，此后生物量保持相對穩定至48 h。當培養溫度為31℃時，酵母菌的快速增殖期較25℃和28℃時稍晚一點，但其最大生物量相當，不過，隨著發酵時間的延長，31℃時的生物量下降明顯，可能是溫度過高不利于酵母菌的生長。在培養溫度為34℃和37℃時，酵母菌的生長明顯受到抑制，表現為快速增殖期來得更晚，且最大生物量較低溫時要小；隨著發酵時間的延長，酵母菌生物量顯著下降，即高溫時酵母菌的衰亡期也提前了，穩定時間變短。因此，酵母菌不利于在較高的溫度條件下培養，以28℃時生長最好。

2.2 響應面分析

根據單因素試驗的結果比較，葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀和酵母膏對酵母菌的生長有顯著影響，但由于以上各因素存在一定程度的交互影響，因此選擇此4個因素作為考察的4個變量，用Design-Expert 7.0軟件對以上4個變量進行Box-Behnken設計（見表1），以發酵體系的OD600為響應值對處理進行響應面分析（見表2）。利用軟件對不同處理方法產生的結果進行分析后建立二次響應面回歸模型，并根據擬合的回歸方程得出最優工藝參數，確定最優響應因子水平。

表1 Box-Behnken設計中各因素水平

本試驗采用Box-Behnken設計法，在培養溫度為28℃條件下，對酵母菌的發酵培養條件進行4因素3水平的響應面分析試驗，OD600的測定結果見表2。

表2 響應面試驗的OD值測定結果

通過Design Expert7.0軟件對優化試驗數據進行二次多項式回歸擬合，獲得OD600對葡萄糖、酵母膏、K2HPO4和MgSO4等4種營養組分的二次多項式回歸方程：

二次響應面分析模型的各因子在模型中的顯著水平如表3所示。當置信度為95%時，即“Prob＞F”小于0.05，模型以及模型中的B、C、D因子、A因子的二次項、B因子的二次項和D因子的二次項等均顯著，且各因素對響應值的影響效果依次為酵母膏＞K2HPO4＞MgSO4＞葡萄糖。所考察的各因素之間均不表現出明顯的交互作用，可能的原因是葡萄糖作為碳源和能源物質，酵母膏含有氮源和生長因子等，而K2HPO4和MgSO4分別滿足菌體生長對鉀、鎂、磷、硫等元素的需要。因此，各因子在產朊假絲酵母生長過程中所起的營養作用不同，交互影響并不顯著。

根據此二項式可以求得當OD600值最高時（最高值為1.782）葡萄糖的濃度為19.86 g/l，酵母膏濃度為9.56 g/l，K2HPO4濃度為 1.45 g/l，MgSO4濃度為 1.12 g/l。利用以上優化后所得的參數值進行驗證，共重復3次，得酵母菌發酵液OD600平均值為1.911，為預測值的107.2%，說明模型具有良好的重現性。

表3 響應面試驗的方差分析

本試驗根據二次多項模型并利用Design Expert7.0軟件繪制出響應面分析圖（見圖7)，每個響應面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時其他2個變量保持在0（編碼為0）水平。

圖7 各因素相互作用的響應面分析3D和等高線圖

3 結論

利用單因素試驗和響應面分析結合的方法，獲得產朊假絲酵母的最優發酵條件為：葡萄糖的濃度為19.86 g/l、酵母膏濃度為 9.56 g/l、K2HPO4濃度為 1.45 g/l、MgSO4濃度為1.12 g/l，pH值5，溫度28℃。

[1]何東東,張坤生.高產食用蛋白質產朊假絲酵母的選育及發酵條件優化[J].食品科學,2009,30(21):210-213.

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[3]吳遠根,王廣莉,詹深山,等.產朊假絲酵母改善麻瘋樹提油餅粕營養效價的研究[J].飼料工業,2009,30(18):35-39.

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