維生素A、D對肉雞鈣磷代謝相關激素水平的影響

曹 平孫建萍閆素梅 方麗惠,3史彬林郭曉宇付果花

（1.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特 010018；2.錫林郭勒職業學院，內蒙古錫林浩特 026005；3.包頭師范學院，內蒙古包頭 014030）

骨骼代謝障礙是降低肉雞生產中經濟效益的重要因素之一。目前，在肉雞生產中，為了提高生產性能和免疫性能，生產廠家往往添加較高劑量的維生素A。然而，許多研究表明，維生素A過量是引起肉雞鈣磷代謝異常、骨骼發育不良及生長發育遲緩的原因之一[1-3],但關于過量維生素A對肉雞鈣磷代謝影響的機理研究很少。鈣結合蛋白（CaBP）主要存在于鳥類的腸道組織中，有研究發現，小腸上皮細胞內CaBP含量與腸鈣吸收量呈正相關，因此認為CaBP在禽類腸鈣吸收過程中起重要作用（Bouhtiauy等，1994）[4]。骨鈣素（BGP）是由成骨細胞合成的一種依賴于維生素K非膠原蛋白，存在于骨骼組織中。血液BGP含量與成骨細胞的活性呈正相關，與骨的形成有關，可作為骨形成的標志物（Demer，1992）[5]。維生素 D3在肝細胞微粒體和線粒體中25-羥化酶的作用下，生成25-(OH)D3。隨后進入腎臟，在腎小管細胞線粒體的1-α羥化酶催化下，25-(OH)D3轉化成維生素D的最終活性形式1,25-(OH)2D3，然后轉運到腸道、腎臟或其它靶組織中，調節鈣磷代謝。Metz等（1985）[6]的研究指出，給幼齡火雞飼喂大劑量維生素A和正常劑量的維生素D3以后,火雞出現類似佝僂病的癥狀；但在給火雞飼喂大劑量維生素A的同時，飼喂大劑量的維生素D3，火雞的骨骼生長基本正常，提示維生素D對維生素A具有一定拮抗作用，同時也說明維生素A過量對火雞的骨骼發育是否產生負面影響，與維生素D的添加劑量有關。金久善等（1994）[7]的研究指出，乳?？诜髣┝康木S生素A造成骨骼鈣磷代謝的紊亂，與過量的維生素A對維生素D3的拮抗作用有關，結果表明，大劑量維生素A組的乳牛維生素D3的活性代謝產物25-羥維生素D3和1，25-二羥維生素D3的生成減少，進而影響鈣磷代謝。此外，肉雞的鈣磷代謝過程還受到甲狀旁腺激素（PTH）及降鈣素（CT）等激素的調節（Meyer等，1992）[8]。維生素A過量對肉雞鈣磷代謝的影響可能與這些活性物質或激素的分泌發生改變有關，同時也與維生素D的添加劑量有關，但相關的研究報道極少。鑒于此，本論文在前期試驗研究的基礎上，通過研究維生素A、D對鈣磷代謝相關激素水平的影響，進一步探討過量維生素A對肉雞骨骼代謝的影響機理，為科學確定日糧中維生素A、D的適宜添加量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 飼養管理與基礎日糧

試驗雞采用涂塑肉雞籠單層籠養，雞籠均采用紅外線加熱裝置自動控溫。試驗雞自由采食，自由飲水，按常規的免疫程序進行免疫。各組的試驗條件均保持一致。每天觀察雞群精神狀態，其余管理同肉雞常規飼養管理。試驗的基礎日糧除維生素A、D按照試驗設計添加外，其他營養成分均滿足肉仔雞的營養需要?；A日糧組成及營養水平詳見表1。

表1 基礎日糧組成及營養水平（風干基礎）

1.2 試驗動物及分組

試驗選擇8日齡健康艾維茵雄性肉雞384只，隨機分成16個處理組，每個處理3個重復組，每個重復組8只雞。采用4×4完全隨機試驗設計，在基礎日糧中分別添加不同劑量的維生素A、D構成試驗日糧。其中維生素A設4個添加水平，分別為1 500、3 000、15 000和45 000 IU/kg日糧，維生素D設4個添加水平，分別為 500、1 250、2 500和5 000 IU/kg日糧，共構成16個處理組的試驗日糧。

1.3 樣本采集

試驗進行至第35 d，早8：00，在每個重復組中隨機抽取2只雞，每處理6只，翅靜脈采血10ml放置于普通采血管(非抗凝)中，在4℃下3000r/min離心制備血清，－20℃冷凍保存備用。

1.4 測試項目與方法

1.4.1 血清CaBP含量

血清CaBP含量采用放射免疫分析法(RIA)測定。測試儀器為GC-911-γ-放射免疫計數器(中國科技大學實業總公司生產)，檢測試劑盒由美國Sigma公司提供。

1.4.2 血清BGP、CT含量

血清BGP、CT含量采用放射免疫分析法（RIA）測定。測試儀器為GC-911-γ-放射免疫計數器(中國科技大學實業總公司生產)，檢測試劑盒由北京華英生物技術研所提供。

1.4.3 血清活性維生素D3與PTH含量

血清活性維生素D3與PTH含量采用放射免疫分析法（RIA）測定。測試儀器為GC-911-γ-放射免疫計數器(中國科技大學實業總公司生產)。活性維生素D3檢測試劑盒由美國索靈(DIASORIN)公司提供，PTH檢測試劑盒由美國實驗室診斷系統DSL有限公司提供。

1.5 數據處理

試驗數據利用SAS(SAS Institute，1998)軟件的Anova法進行方差分析，Duncan氏法進行多重比較，同時對不同維生素A、D的日糧處理主效應分別進行一次線性回歸和一元二次回歸分析。以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準，P＜0.10表示差異趨于顯著。

2 結果與分析

2.1 維生素A、D對肉雞血清CaBP、BGP含量的影響（見表2)

由表2可以看出，維生素A水平對血清CaBP含量無顯著的影響（P=0.79），但回歸分析統計結果表明，血清CaBP含量與日糧維生素A水平的增加劑量趨于顯著的一次線性降低劑量依賴關系(P=0.092)，回歸方程為 y=-3.652E-5x+32.21，R2＝0.82。式中，x 為日糧維生素A的添加量；y為血清CaBP含量。其中，以1 500、3 000 IU/kg維生素 A組較高，15 000 IU/kg維生素A組較低，45 000 IU/kg維生素A組最低。日糧維生素D及維生素A、D交互作用對血清CaBP含量無顯著影響（P=0.57，P=0.72）。結果也表明，日糧維生素A水平對肉雞血清BGP含量的影響趨于顯著 (P=0.08)，其中，45 000 IU/kg維生素A組血清BGP含量最低，有明顯低于1 500 IU/kg維生素A組的趨勢?；貧w分析結果表明，隨著日糧維生素A水平的增加，血清BGP含量呈現一定的一次線性降低趨勢 (P=0.17)，回歸方程為 y=-3.80E-6x+3.46，R2＝0.69。式中，x為日糧維生素A的添加量，y為血清BGP含量。日糧維生素D對血清BGP含量無顯著影響(P=0.54)，但隨著日糧維生素D水平的增加，血清BGP含量呈現一定的一次線性增加趨勢 (P=0.14)，回歸方程為y=3.69E-5x+3.34，R2＝0.74。式中，x為日糧維生素 D 的添加量，y為血清BGP含量。維生素A、D交互作用對血清BGP含量無明顯的互作效應(P=0.67)。

表2 日糧維生素A、D對肉雞血清CaBP、BGP含量的影響

2.2 維生素A、D對肉雞血清CT、PTH及維生素D3含量的影響(見表3)

表3 日糧維生素A、D對肉雞血清CT、PTH和VD3的影響

表3的結果表明，日糧維生素A、D水平及其交互作用對血清CT含量均無顯著影響(P＞0.05)。但回歸分析統計結果表明，隨著日糧維生素A水平的增加，血清CT含量呈現一定的一次線性降低趨勢(P=0.18)，回歸方程為y=-0.21E-3x+128.73，R2=0.67。式中，x為日糧維生素A的添加量；y為血清CT含量。其中，1 500 IU/kg維生素 A組最高，3 000、15 000 IU/kg維生素A組較低，尤以45 000 IU/kg維生素A組最低。日糧維生素A水平對血清PTH含量雖然無顯著的影響(P=0.20)，但回歸分析統計結果表明，血清PTH含量隨著日糧維生素A水平的增加而增加，并呈顯著的一次線性(P=0.029)劑量依賴關系，回歸方程為y=8.31E-5x+30.84，R2=0.94。式中，x為日糧維生素A的添加量，y為血清PTH含量。其中，15 000、45 000 U/kg維生素A組血清PTH含量較高，尤以45 000 IU/kg維生素A組最高。日糧維生素D水平及維生素A、D交互作用對血清PTH含量均無顯著影響 (P=0.88，P=0.95)。

日糧維生素A水平對血清維生素D3含量無顯著影響(P=0.87)。但回歸分析統計結果表明，血清維生素D3含量隨著日糧維生素A水平的增加而降低，并呈一定的一元二次(P=0.12)劑量依賴關系，回歸方程為y=6.38E-9x2-3.57E-4x+37.66，R2=0.99。式中，x為日糧維生素A的添加量，y為血清維生素D3含量。日糧維生素D水平對血清維生素D3含量的影響趨于顯著(P=0.08)，5 000 IU/kg維生素D組血清維生素D3含量較其它三組有顯著增加趨勢，2 500 IU/kg維生素D組血清維生素D3含量也較高；回歸分析結果表明，血清維生素D3含量與日糧維生素D水平間呈現趨于顯著的一次線性增加的劑量依賴關系(P=0.093)，回歸方程為y=0.002 4x+30.07，R2=0.82。式中，x為日糧維生素D的添加量，y為血清維生素D3含量。維生素A、D交互作用對血清維生素D3含量無顯著影響(P=0.42)。

3 討論

3.1 日糧維生素A對肉雞血清CaBP、BGP、CT、PTH及維生素D3含量的影響

很多資料研究得出，過量的維生素A可引起肉雞鈣磷代謝的紊亂。閆素梅等（2007）[2]、馮永淼等（2007）[3]的前期試驗研究進一步驗證了該結果，研究表明：日糧添加過量的維生素A（45 000 IU/kg）時，肉雞脛骨強度顯著降低，生長發育有顯著的降低趨勢；日糧添加臨界過量的維生素A（15 000 IU/kg）時，脛骨鈣含量、血清AKP活性有降低的趨勢，脛骨磷含量升高，生長發育有顯著的降低趨勢；但關于其影響機理尚不十分清楚。CaBP主要存在于鳥類的腸道組織中，研究發現小腸上皮細胞內CaBP含量與腸鈣吸收量呈正相關，因此認為CaBP在禽類腸鈣吸收過程中起重要作用（Bouhtiauy等，1994）[4]。本試驗結果顯示，隨著日糧維生素A水平的增加，血清CaBP含量呈趨于顯著的一次線性降低趨勢（P＜0.10）；其中，以 15 000、45 000 IU/kg維生素A組較低，45 000 IU/kg維生素A組對其降低效果更為明顯。血清CaBP濃度的降低，可能會引起鈣在腸道中的吸收受阻，進而引起骨骼鈣磷代謝異常。關于維生素A過量引起血清CaBP濃度降低的機制尚不清楚。Matsumoto等（1998）[9]的研究發現，維生素A的中間代謝產物視黃酸參與依賴維生素D的CaBP基因表達。馮永淼（2007）[10]試驗研究表明，隨著日糧維生素A添加量的增加，十二指腸CaBP基因表達降低，當維生素A水平增加至15 000、45 000 IU/kg時，十二指腸的CaBP基因表達量有下降的趨勢，提示日糧維生素A過量（15 000～45 000 IU/kg）時，可引起肉雞的血清CaBP濃度降低，與其抑制了組織中CaBP基因表達有關，進而影響了鈣磷代謝。

BGP又稱骨依賴維生素K蛋白，主要由成骨細胞合成、釋放，并分泌于骨基質中。血液BGP含量與成骨細胞的活性呈正相關，與骨的形成有關，可作為骨形成的標志物（Demer，1992）[5]。早期研究結果表明，BGP在骨骼生長、羥磷灰石沉積時增加，有利于骨骼的生長，在調節骨骼代謝中起著重要的作用[11]。本試驗結果得出，維生素A過量組（15 000、45 000 IU/kg）的血清BGP含量呈顯著的降低趨勢。由此推斷，日糧過量維生素A對肉雞骨骼發育及鈣磷代謝的負面影響與BGP的濃度降低進而影響骨骼的礦化過程有關。關于維生素A引起BGP濃度降低的機理研究尚不多見。陶天遵等（2005）[12]指出，維生素K是BGP中谷氨酸γ位羧化的重要輔酶，影響BGP的生物活性與生物合成。當日糧維生素K缺乏時，引起動物機體血清與骨骼中BGP的濃度下降，造成骨礦化過程不能進行(Iber，1989)[13]。夏兆飛（1997）[14]的研究結果表明，大劑量的維生素A抑制骨鈣素（BGP）的合成，降低血清鈣磷水平，造成肉雞脛骨礦化不全，引起骨骼代謝異常。

CT是由甲狀旁腺濾泡旁細胞分泌的一種活性激素，是動物體內調節鈣磷代謝的重要激素之一。CT是強有力的骨吸收拮抗劑，破骨細胞上存在其受體，CT在幾分鐘內能迅速抑制破骨細胞的活性，長期則抑制其增殖，使破骨細胞數量減少，從而抑制骨吸收，降低骨轉換，以降低血鈣磷含量，對骨有保護作用（曹國凡等，2008）[15]。血 Ca2+是影響 CT分泌的主要因素，與 CT含量呈正相關。本試驗結果表明，隨著日糧維生素A水平的增加，血清CT含量呈一定的一次線性降低趨勢，但關于其影響機理尚不清楚，相關的研究報道也少見。閆素梅等（2007）[2]的前期研究結果得出，隨日糧維生素A水平的增加，血清鈣含量呈顯著的一次線性降低趨勢，與本試驗結果相吻合。提示，過量維生素A引起血清CT濃度降低與血鈣含量的降低有關。提示，過量維生素A可降低血清CT的含量，與血鈣含量的降低有關，即過量維生素A引起血清CT含量的降低是鈣代謝紊亂的一種適應調節。

PTH是調節骨轉換及骨骼鈣磷代謝的最為重要的肽類激素之一。池肇春（1984）[16]研究報道，PTH的分泌及進入血液循環主要受血漿Ca2+濃度的調節，血鈣含量低于正常水平促進PTH分泌，高于正常則抑制其分泌。閆素梅等（2007）[2]的研究結果得出，隨日糧維生素A水平的增加，血清鈣含量呈顯著的一次線性降低趨勢。本試驗結果表明，隨著日糧維生素A水平的增加，血清PTH含量呈顯著的一次線性增加（P=0.029）；提示，過量維生素A引起血清PTH的濃度降低與血鈣含量的降低有關，即過量維生素A引起血清PTH含量的增高是鈣代謝紊亂的一種適應調節。

維生素D3必須經過兩次酶促羥化階段轉化成為1，25-（OH）2D3才能具有生物活性。1，25-（OH）2D3在腸道、腎臟及骨骼中均具有調節鈣磷水平的重要作用（朱建軍等，2009）[17]，通過激活鈣磷離子在腸上皮細胞的主動轉運，增加鈣磷吸收，提高血液鈣磷水平，保證骨骼正常鈣化。一些研究表明，過量維生素A對維生素D具有拮抗作用，維生素A到達消化吸收部位前，部分損壞維生素D，干擾了維生素D3的正常吸收和代謝(Metz等，1985；Veltmann 等，1985)[18-19]。金久善等（1994）[7]的研究指出，乳牛口服大劑量的維生素A造成骨骼鈣磷代謝的紊亂，與過量的維生素A對維生素D3的拮抗作用有關，結果表明，大劑量維生素A組的乳牛維生素D3的活性代謝產物25－羥維生素D3和1，25－二羥維生素D3的生成減少，進而影響鈣磷代謝。本試驗結果表明，隨日糧維生素A水平的增加，血清維生素D3含量呈一定的一元二次降低趨勢，進一步驗證了過量維生素A對維生素D的拮抗作用。由此推斷，過量維生素A可能通過抑制維生素D的吸收，引起維生素D3水平的降低，進而影響鈣磷的轉運和骨骼的鈣化，導致肉雞鈣磷代謝紊亂。

3.2 日糧維生素D對肉雞血清CaBP、BGP、CT、PTH及維生素D3含量的影響

王松艷等（1999）[20]研究報道，缺乏維生素D的日糧可引起肉雞體內活性代謝產物減少，血清鈣磷含量降低，骨重吸收增加，骨密度、骨礦含量、股骨重等均低于正常組。閆素梅等（2007）[2]研究結果表明，日糧維生素D水平在500～5 000 IU/kg范圍內，隨著日糧中維生素D添加劑量的增加，血清鈣磷含量呈一次線性增加趨勢，脛骨鈣含量呈顯著的一元二次曲線上升趨勢。本試驗結果表明，日糧維生素D水平對肉雞血清BGP及維生素D3水平的影響呈一定劑量依賴性，隨日糧維生素D水平的增加，血清活性維生素D3含量呈趨于顯著的一次線性增加趨勢（P=0.093），血清BGP含量呈現一次線性增加趨勢(P=0.14)，提示高劑量的維生素D水平對過量維生素A有弱的拮抗作用，可以緩解過量維生素A對骨骼代謝產生的不利影響。Metz等（1985）[6]的研究指出，給幼齡火雞飼喂大劑量維生素A和正常劑量的維生素D3以后,火雞出現類似佝僂病的癥狀；但在給火雞飼喂大劑量維生素A的同時，飼喂大劑量的維生素D3，火雞的骨骼生長基本正常，提示維生素D對維生素A具有一定拮抗作用，與本試驗結果相似。

本試驗結果也得出，日糧維生素A水平在1 500～45 000 IU/kg范圍內，維生素D水平在500～5 000 IU/kg范圍內，維生素A、D交互作用對肉雞血清CaBP、BGP、PTH、CT及維生素D3含量的影響均不顯著，但是相關的研究報道很少，確切的結果還有待于進一步的研究探討。

4 結論

在本試驗條件下，初步得出以下結論：

① 45 000 IU/kg維生素A組血清BGP含量最低，有顯著低于1 500 IU/kg維生素A組的趨勢(P=0.08)。日糧維生素A水平在1 500～45 000 IU/kg范圍內，隨著日糧維生素A水平的增加，血清CaBP含量呈趨于顯著的一次線性降低趨勢（P=0.092），維生素D3含量與CT濃度也呈一元二次降低趨勢（P=0.12）及一次線性降低趨勢（P=0.18），其中，以 15 000、45 000 IU/kg維生素A組較低，尤以45 000 IU/kg維生素A組最低，血清PTH含量呈顯著的一次線性增加（P=0.029）。

②日糧維生素D水平在500～5 000 IU/kg范圍內，隨著日糧維生素D水平的增加，血清維生素D3含量呈趨于顯著的一次線性增加趨勢（P=0.093），血清BGP濃度也呈一次線性增加趨勢（P=0.14）；其中，以2 500和5 000 IU/kg時較高，5 000 IU/kg時最高。

③過量維生素A引起的肉雞骨骼鈣磷代謝發生障礙與血清CaBP含量的降低及PTH濃度的增加有關，也與過量維生素A對維生素D的拮抗作用有關。

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