凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜分離同時測定飼料中3 0種有機磷農藥殘留

韓 梅

(四川省農科院分析測試中心，四川成都 641400)

有機磷農藥作為一類高效、廣譜的殺蟲劑、除草劑被廣泛地用于農業生產中,但其使用后可能會殘留在農作物上，另一方面，某些有機磷如敵敵畏會作為驅蟲劑添加在飼料中[1]。將不可避免地在飼料的加工生產和流通中形成殘留而造成污染[2]，這些農藥殘留物，可長期隨飼料進入人、畜機體，影響動物性食品的安全[3]，危害人體健康，所以飼料中有機磷農藥殘留的檢測具有重要的意義。當然飼料中農藥殘留不是飼料質量安全的主流，但是及時了解和掌握動物飼料中的農藥殘留狀況，監測農藥殘留的來源，關注可能存在的飼料質量安全風險隱患，可以防患于未然[2]。近年來，關于飼料中的多種有機磷農藥的凝膠色譜凈化及檢測方法與技術，在國內研究的不多，有用丙酮提取[9]，硅膠層析柱凈化，火焰光度檢測器（FPD）檢測，有用乙酸乙酯提取[5]，有用乙腈提取直接上機[6]，有用QuECh ERS方法凈化，質譜檢測器檢測[7-8]。在本文中考慮到混配飼料成分復雜，采用乙腈提取，凝膠滲透色譜凈化,火焰光度檢測器（FPD）檢測,初步建立混配飼料中常見的30種有機磷農藥殘留的測定方法。

1 試驗材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀(美國AgiLent7890A)，配有FPD檢測器、7683B自動進樣器；凝膠滲透色譜儀（美國J2 Scientific）,配有內充Bio-Beads S-X3玻璃柱(內含凝膠22 g,20 cm×2 cm）;旋轉蒸發儀（瑞士 Büchi），離心機。樣品為混配飼料。

丙酮、乙腈均為色譜純；乙酸乙酯、環己烷為分析純，去離子水；氯化鈉為分析純;敵敵畏等30種有機磷農藥標液購于北京中國標準技術開發公司標樣開發部,均為 100 mg/l。

標準溶液的配制：將30種農藥逐一準確吸取一定體積的標液分別注入一容量瓶中，用丙酮稀釋定容至刻度，配制單一農藥儲備液。采用同樣方法配制農藥混標儲備液。根據實驗需要，用丙酮稀釋成不同濃度的混合標準工作液。

1.2 色譜條件

色譜柱：DB-50+石英毛細管柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm), 載氣為氮氣(純度＞99.999%)，恒流；流量2.0 ml/min。空氣流量120 ml/min，氫氣流量75 ml/min。柱溫：初溫100℃，保持1 min，以25℃/min升至200℃，再以8℃/min升至240℃，保持10 min。進樣口溫度230℃；檢測器溫度250℃；尾吹流量60 ml/min。進樣方式為不分流進樣；進樣量1.0 μl。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品提取及濃縮

取試樣5.0 g（過20目篩）置于50 ml離心管中，加入10 ml水充分濕潤，放置30 min后加入20 ml乙腈，渦旋混合，勻漿1 min，再加入氯化鈉3～5 g，再勻漿1 min，將離心管以 4 200 r/min速度離心30 min，準確吸取離心后的上層清液10.0 ml收集到雞心瓶中，40℃水浴旋至近干，用環己烷：乙酸乙酯(1：1)溶劑置換1～2次，準確取10.0 ml乙酸乙酯：環己烷（1：1 v/v）溶解殘渣，過0.45 μm濾膜，供凝膠凈化。

1.3.2 凝膠色譜(GPC)凈化

凈化試驗選擇了2.0 mg/l的混合標樣用環己烷：乙酸乙酯（1：1）置換1～2次，直接過凝膠滲透色譜柱，采用體積比為1：1的乙酸乙酯-環己烷作為流動相，進樣量為5.0 ml，流速為4.7 ml/min，從7 min起每1 min收集流出液，共收集14份溶液，40℃水浴旋至近干定容，分別用氣相色譜檢測各段流出液中30種有機磷農藥的含量。同時，樣品提取液過凝膠凈化時收集9～18 min流出組分于旋蒸瓶中，40℃旋轉蒸發至近干，用丙酮定容至2.5 ml，供氣相色譜測定。

1.3.3 標準系列制備方法

分別吸取混合標準儲備液用丙酮稀釋，配成0.05～2.0 μg/ml的標準系列使用液。按照1.2色譜分析條件進行測定，進樣量為 1.0 μl。

2 結果與討論

2.1 提取方法的選擇

農藥殘留分析中常用于提取農藥的有機溶劑有丙酮、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷等,有些溶劑對人體的毒性較大如二氯甲烷[4]，長期接觸會給實驗分析人員的健康造成一定的危害；有些溶劑如丙酮的極性太強，在提取農藥的同時也將大量的雜質提取出來，不利于后續的凈化。本方法選用對人毒害性較低的乙腈作為提取溶劑,既能保證提取的油脂、色素等雜質較少又對農藥有廣泛溶解性，有利于分析人員的身體健康。另外，對于提取方式，通常的機械振蕩所需的時間較長,一般需要幾十分鐘,而高速勻漿機勻漿只需1～2 min，且提取效率比前者更好，本文選勻漿方式提取飼料中的農藥。

2.2 樣品凈化條件的選擇

凈化是飼料樣品中30種有機磷農藥殘留檢測方法研究中的關鍵步驟。因為混配飼料是根據養殖對象營養需要，將多種營養成分的飼料原料按一定比例科學調配、加工而成的飼料。除了五谷雜糧，通常還添加有魚粉、肉骨粉，其中含有一定量的油脂和多糖等大分子組分的復雜基質，提取后直接上機會污染儀器系統，導致儀器靈敏度下降。柱層析等凈化方法不能有效地將干擾雜質除去，且操作步驟繁雜。但是選用填料為中性、多孔的Bio-Beads SX-3作為GPC柱填料，使用自動化GPC系統不僅能進行有效的分離凈化，而且還大大節約了時間和溶劑[4]。本實驗選用體積比為1：1的乙酸乙酯-環己烷溶液作為流動相,流速為4.7 ml/min，按1.3.2方法每1 min收集一份樣品,共收集14份樣品溶液,分別進行GC-FPD檢測各段流出液中組分的含量，發現9 min以前的收集液中未檢出農藥,第10 min的收集液中開始檢出農藥,大部分有機磷農藥在11～14 min流出，有較高的回收率，15～17 min只有丙溴磷和硫環磷組分還有流出，18 min以后的收集液中未檢出農藥。另一方面，通過對空白樣品分段流出液的分析，大部分的大分子雜質如脂肪在9 min以前就去除了，考慮到凝膠色譜柱保留時間的波動性，可在農藥流出的時間段前后多截取1 min，因此,選定樣品過凝膠柱凈化的收集時間為第9～18 min共收集10 min流出液。

空白樣品萃取液經過GPC凈化GC-FPD檢測，其色譜圖見圖1。圖2為GPC凈化收集9～18 min餾分時農藥添加色譜圖,從圖中看出30種有機磷農藥能夠有效的分離，分離效果好，達到了農殘分析的要求。

2.3 線性關系、檢出限

稱取已知不含農藥的飼料樣品,按照本法的提取凈化條件經GPC凈化并旋至近干后,分別向其中添加一定體積的2 mg/l的30種農藥的混合標準溶液,配制成一定質量濃度系列標準溶液,與空白樣品同時進行測定,以各組分的峰面積(A)對質量濃度(C,mg/l)繪制標準曲線。同時,以最低質量濃度點的響應值與空白樣品中噪聲響應的3倍計算最低檢出限(LOD)，方法的線性關系、檢出限結果見表1。表1中的數據表明,在0.05～2 mg/l質量濃度范圍內,方法的線性關系良好,相關系數均大于0.99，30種農藥的最低檢出限為5.6～54 μg/kg。

2.4 方法的精密度和回收率

定量添加上述30種農藥的混合標準溶液于空白飼料樣品中，添加濃度分別為0.050、0.10、0.20 mg/kg，每一濃度水平下作3個平行樣。添加后按照“1.3”節所述步驟進行提取、濃縮、凈化和測定,試驗結果見表2。

表2中的數據表明，30種農藥在所有添加水平下的平均加標回收率為71.3%～114.1%，相對標準偏差(RSD%)為0.3%～14.8%(n=3)，在添加水平低的情況下其RSD%較大。

表1 30種農藥的保留時間、線性方程、相關系數和檢出限

表2 方法的添加回收率和精密度(n=3)

3 結論

本文建立了GPC凈化，GC-FPD快速檢測飼料中30種有機磷農藥殘留的方法。使用凝膠滲透色譜凈化技術,能夠去除飼料樣品中脂肪和色素等大分子雜質，操作簡單，自動化程度高，能夠滿足大量樣品的快速檢測要求，另一方面FPD檢測器有足夠的靈敏度和選擇性可很好地用于飼料中多種有機磷的測定。

[1]周國安.飼料手冊[M].北京:中國農業出版社,2002:294-295.

[2]解沛,王征南,范潤梅.中外飼料產業發展概況和飼料質量安全問題現狀[J].飼料工業,2010,31(1):56-60.

[3]邊連全.農藥殘留對飼料的污染及其對畜產品安全的危害[J].飼料工業,2005,26(9):1-5.

[4]劉詠梅,王志華,儲曉剛.凝膠滲透色譜技術在農藥殘留分析中的應用[J].分析測試學報,2005,24(2):123-127.

[5]李愛軍,盧利軍,牟峻,等.日本神戶牛飼用稻草中多種有機磷殘留量測定的研究[J].飼料研究,2010(11):43-45.

[6]段偉偉,楊麗杰,霍貴成.飼料中有機磷農藥殘留的檢測[J].飼料工業,2009,30(9):36-38.

[7]李永剛,趙揚,李曉芳,等.氣質聯用快速檢測飼料中29種農藥殘留[J].飼料研究,2009(7):49-52.

[8]潘娟,華賢輝,商軍.飼料中36種殘留農藥的氣相色譜-質譜法檢測方法[J].飼料工業,2009,30(11):37-40.

[9]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.GB/T 18969—2003[S].中華人民共和國國家標準—飼料中有機磷農藥殘留量的測定.北京：中國標準出版社,2002-02-21.