IAC-HPLC熒光檢測法測定飼料中的玉米赤霉烯酮方法研究

饒正華 李 蘭

(中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所

[國家飼料質量監督檢驗中心（北京）]，北京 100081)

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一種具強烈致畸作用的生殖系統霉菌毒素，我國飼料衛生標準中規定了配合飼料和玉米的允許量≤0.5 mg/kg，但我國現有的ZEN檢測標準中使用的薄層色譜法為半定量法，酶聯免疫吸附法為篩選法，兩種方法都不是準確定量法，因此，建立準確高效的檢測方法對于檢測和控制飼料中玉米赤霉烯酮含量具有重要意義。

免疫親和柱（IAC）由于其高選擇性、高靈敏度、凈化效果好、易操作的特點而被普遍用于霉菌毒素的檢測。國際標準ISO 17372:2008采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法對飼料中玉米赤霉烯酮進行檢測，類似技術路線在檢測大豆、油菜籽、植物油等中的玉米赤霉烯酮時也廣泛使用。本研究旨在建立飼料中玉米赤霉烯酮的IAC-HPLC熒光檢測法。

1 材料與方法

1.1 儀器

振蕩器、氮吹儀、高速均質器、高效液相色譜儀（配有熒光檢測器）；色譜柱：C18柱，長150 mm，內徑4.6 mm，粒度5 μm；真空裝置或空氣壓力泵；玻璃微纖維濾紙（直徑 11 cm、孔徑 1.5 μm）；試驗篩（1 mm孔徑）。

1.2 試劑及材料

玉米赤霉烯酮免疫親和柱（容量≥2 μg）；乙腈、甲醇；氫氧化鈉溶液：CNaOH=0.2 mol/l；玉米赤霉烯酮標準品，玉米赤霉烯酮含量≥99.5%；提取劑：乙腈+水（8+2）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：將 8 g氯化鈉、1.16 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀溶解至1 000 ml水中，用氫氧化鈉溶液調節pH值至7.4；流動相：量取460 ml乙腈至1 000 ml的容量瓶中，加入460 ml水和80 ml甲醇。混合均勻并通過0.45 μm濾膜，備用。

1.3 標準溶液的配制

玉米赤霉烯酮標準工作液：用流動相分別配制濃度為 0.02、0.05、0.10、0.50、1.0 μg/ml的標準工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

稱取試樣40.0 g于250 ml具塞錐形瓶中,加入4.0 g氯化鈉及100.0 ml提取劑,于振蕩器上振蕩60 min,或于高速勻質器勻質2 min后，用定量濾紙過濾，準確移取10.0 ml濾液并加入40.0 ml PBS溶液稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1～2次，至濾液澄清，備用。

1.4.2 凈化

將免疫親和柱連接于10.0 ml玻璃注射器下。準確移取10.0 ml樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，抽干。分別以10.0 ml純水淋洗柱子兩次并抽干。準確加入1.5 ml甲醇洗脫，流速不大于2 ml/min，收集洗脫液于55℃氮氣吹干，用1.0 ml流動相溶解殘渣，渦旋混勻，過0.45 μm濾膜，上機測定。

1.4.3 測定

色譜測定流速：0.8 ml/min；檢測波長：激發波長274 nm；發射波長 440 nm；進樣量：20 μl；柱溫：30 ℃。分別取相同體積樣液和標準溶液注入高效液相色譜儀，在同等色譜條件下測定試樣的響應值（峰高或峰面積），經過與玉米赤霉烯酮標準溶液圖譜比較響應值得到試樣中玉米赤霉烯酮的濃度。

2 結果與討論

2.1 干擾性試驗

玉米赤霉烯酮類的六種類似物分別為玉米赤霉烯酮（ZEN）、玉米赤霉醇（ZER）、β-玉米赤霉醇（β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZOL）、玉米赤霉酮（ZAN）。

該六種物質可以應用于HPLC紫外法檢測，經過玉米赤霉烯酮免疫親和柱凈化后，六種物質回收率都大于80%（見圖1）。

六種物質中,玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇三種可以用熒光檢測器檢測。該三種物質應用玉米赤霉烯酮IAC凈化后,從圖2中可以看出,IAC-HPLC熒光檢測法可以很好地將三種物質分開。

2.2 標準曲線與線性范圍

配制 ZEN 標準液濃度分別為 5、20、50、200、500 μg/ml，按上述試驗條件進樣，以所得峰面積A對濃度（μg/ml）進行回歸分析，結果表明線性關系良好（見圖3）。回歸方程為y=1 848.6x-484 3，相關系數為0.999 9。

2.3 準確度與精密度試驗

分別選擇配合飼料、預混料、魚粉、豆粕、濃縮飼料、玉米不同產品進行添加回收率試驗。空白樣品選擇不含有玉米赤霉烯酮或含量較低的樣品（含有玉米赤霉烯酮的需扣除空白，見圖4）。樣品中添加不同濃度的標準溶液，充分搖勻，使標準溶液與樣品充分吸收，按照本試驗方法進行測定，其回收率見表1。

表1 飼料中添加玉米赤霉烯酮的準確度回收率試驗

上述不同樣品，在添加不同濃度的情況下，回收率為90.1%～118%，回收效果較好。

表2 飼料中添加玉米赤霉烯酮的精密度回收率試驗（%）

利用魚粉、預混料、雞配合飼料、玉米進行添加試驗。樣品中添加不同濃度的標準溶液，充分搖勻，使標準溶液與樣品充分吸收，每個添加水平重復測定7～9次，按照本試驗方法進行測定，其回收率相對偏差見表2。

從表2中數據可以看出，在本方法規定的條件下，回收率數據為80.3%～102.3%，相對標準偏差均在5%以內。

3 結論

玉米赤霉烯酮六種類似物中只有玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇可以用熒光檢測器檢測出來，通過圖譜可以看出，此方法能較好地將這三種物質區分。本試驗利用配合飼料、預混料、魚粉、豆粕、濃縮飼料、玉米進行不同濃度的添加回收率試驗，回收率為90.1%～118%。利用魚粉、預混料、雞配合飼料、玉米進行方法穩定性試驗，相對標準偏差均在5%以內。因此，本方法中建立的免疫親和柱凈化-熒光檢測器的高效液相色譜法具有良好的特異性、準確性和穩定性。