刺五加多糖對斷奶仔豬血液免疫指標的影響

韓 杰 邊連全 劉顯軍 張 飛 楊侃侃

(1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，沈陽 110866;2.洛陽師范學院生命科學系，洛陽 471022;3.沈陽農業大學科研種豬場，沈陽 110866)

免疫應激能夠使畜禽在行為和代謝上發生改變，如出現厭食、嗜睡，將用于生長的營養物質轉向用于維持免疫反應，最終導致畜禽生長抑制[1-2]。免疫應激的發生與免疫系統被非正常激活有關[3-4]。對3～4周齡的仔豬實施斷奶，由于母源抗體供應中斷，且仔豬自身的免疫系統尚未發育完善，易發生免疫應激，導致仔豬出現生長停滯、飼料效率降低、腹瀉等現象[5]。因此，在畜禽飼糧中添加免疫調節劑是減緩免疫應激的重要措施之一。刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysaccharide，ASPS)是從刺五加根莖中分離出的免疫活性多糖，在體內外均可調節小鼠的細胞免疫和體液免疫功能[6-8]，但將ASPS應用于畜禽生產中的研究鮮見報道。本課題組前期研究已經表明，ASPS應用于斷奶仔豬飼糧中可緩解斷奶仔豬應激反應，增強仔豬的免疫功能，促進仔豬生長[9]。本試驗旨在以早期斷奶仔豬為對象，繼續深入探討ASPS對斷奶仔豬血液免疫指標的影響，為ASPS作為免疫調控劑在仔豬飼糧中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取96頭體重相近的(28±3)日齡“長白×約克夏”二元雜交斷奶仔豬，隨機分為6組，每組4個重復，每個重復4頭豬，試驗期21 d。對照組飼喂不添加抗生素的基礎飼糧，其為參照NRC(1998)仔豬營養需要配制的粉狀配合飼料，基礎飼糧組成及營養水平見表1。試驗組飼喂在基礎飼糧中分別添加150、300、500、800 和1 000 mg/kg ASPS的試驗飼糧。仔豬采用地面飼養，半開放豬舍，自由采食和飲水，免疫和驅蟲程序按豬場常規同步進行。

1.2 試驗材料

1.2.1 試驗儀器

試驗儀器包括LRHS-150B型恒溫恒濕培養箱(北京萊凱博儀器設備有限公司)、BioTek Synergy-2多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)、Uritest-3000型全自動血細胞分析儀(優利特集團有限公司)、過濾除菌裝置和濾膜。

1.2.2 ASPS的提取和分析

采用熱水浸提乙醇沉淀的方法提取ASPS。將干燥至恒重的刺五加根粉碎，過40目篩，在熱水中煮4次，每次2 h，合并濾液，將濾液真空濃縮至1∶1，采用Sevag法除去蛋白質，將上述濾液與等體積的氯仿-正丁醇混合液(體積比為5∶1)振蕩，過濾，取濾液加入4倍體積的無水乙醇，放置過夜，次日3 000×g離心20 min，取沉淀進行低溫蒸干后，加蒸餾水溶解，再加3倍體積的無水乙醇攪拌，干燥后所得的棕黃色粉末即為ASPS。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量為82.5%。

1.3 試驗樣品制備

試驗第21天，從每個重復隨機取1頭仔豬，共24頭，用真空采血管從每頭仔豬的前腔靜脈采集血液2份，1份用普通真空采血管采血5 mL，3 500 r/min離心5 min，分離血清，-20℃冰箱凍存，用于測定血清細胞因子白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白 細 胞 介 素 -4(interleukin-4，IL-4)、干擾素 - γ(interferon-γ，IFN-γ)含量以及免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)抗體水平;1份用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管采血1 mL，用于血細胞分類計數。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 檢測指標及測定方法

1.4.1 血清細胞因子含量和抗體水平測定

血清細胞因子 IL-2、IL-4、IFN-γ含量和 IgG、IgA、IgM抗體水平均采用豬的酶聯免疫吸附試劑盒(ELISA Kit，R ＆ D System，美國)測定，并嚴格按照說明書提供的方法和步驟操作。

1.4.2 外周血細胞分類計數的測定

外周血細胞分類計數采用全自動血細胞分析儀(Uritest-3000)測定。

1.5 數據統計分析

試驗數據經Excel 2003初步整理，然后經SPSS 11.5統計軟件中的一般線性模型(GLM)進行方差分析和二次曲線回歸分析，采用Duncan氏法進行多重比較檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 ASPS對斷奶仔豬外周血細胞分類計數的影響

由表2可知，飼糧中添加ASPS對仔豬外周血紅細胞數量和中性粒細胞數量無顯著影響(P＞0.05)，但能顯著增加外周血白細胞數量和淋巴細胞數量(P＜0.05)，其中500 mg/kg ASPS組和800 mg/kg ASPS組仔豬外周血白細胞數量和淋巴細胞數量均極顯著高于對照組(P＜0.01)，1 000 mg/kg ASPS組仔豬外周血白細胞數量和淋巴細胞數量顯著高于對照組(P＜0.05)。對不同ASPS梯度的飼糧處理效應進行線性和二次曲線回歸分析可知，外周血紅細胞數量(P＜0.05)、白細胞數量(P＜0.01)和淋巴細胞數量(P＜0.01)隨ASPS添加水平增加呈二次曲線變化。

2.2 ASPS對斷奶仔豬血清細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ含量的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加ASPS能顯著提高仔豬血清細胞因子IL-2和IFN-γ含量(P＜0.05);對血清細胞因子IL-4含量無顯著影響(P＞0.05)。其中，添加 500、800和1 000 mg/kg ASPS極顯著提高了血清細胞因子IFN-γ含量(P ＜0.01)，800 mg/kg ASPS顯著提高了血清細胞因子IL-2含量(P＜0.05)。對不同ASPS梯度的飼糧處理效應進行線性和二次曲線回歸分析可知，隨ASPS添加水平增加，IL-2(P＜0.05)和IFN-γ含量(P＜0.01)呈二次曲線變化。

表2 ASPS對斷奶仔豬外周血細胞分類計數的影響Table2 Effects of dietary ASPS on peripheral blood cell differential counts of weaner piglets

表3 ASPS對斷奶仔豬血清細胞因子含量的影響Table3 Effects of dietary ASPS on serum cytokine contents of weaner piglets pg/mL

2.3 刺五加多糖對斷奶仔豬血清IgG、IgA、IgM抗體水平的影響

由表4可知，飼糧中添加ASPS對仔豬血清IgG、IgA、IgM抗體水平均無顯著影響(P＞0.05)。對不同ASPS梯度的飼糧處理效應進行線性和二次曲線回歸分析可知，隨ASPS添加水平增加，仔豬血清IgA抗體水平呈線性變化(P＜0.05)。

表4 ASPS對斷奶仔豬血清IgG、IgA、IgM抗體水平的影響Table4 Effects of dietary ASPS on the antibody levels of IgG，IgA and IgM in serum of weaner piglets g/L

3 討論

一般說來，仔豬可從2種途徑獲得免疫保護，一是通過吮吸母乳獲得母源抗體而建立的被動免疫，二是自然狀態下仔豬自身免疫系統的逐漸發育完善而建立起的主動免疫。對3～4周齡的仔豬實施斷奶，即中斷仔豬的被動免疫保護，而仔豬自身的免疫系統尚未發育完善，主動免疫功能直到仔豬4～5周齡時仍較弱。故仔豬斷奶后特別容易受到環境中的病原微生物的侵害而發生免疫應激，導致仔豬出現生長停滯、飼料效率降低、腹瀉等現象[10-11]。

血細胞是參與機體免疫反應的主要成分，是抵御病原微生物等入侵機體的主要防線。其中，紅細胞是含量最多的血細胞，具有向機體運送O2的重要功能，同時還具有免疫功能。本試驗中，隨ASPS添加水平的增加，仔豬外周血紅細胞數量呈二次曲線變化，這在一定程度上說明ASPS對仔豬的血紅蛋白合成、造血功能和免疫功能的提高有促進作用。白細胞總數及其分類計數的結果可以提示機體的易感性、侵入微生物的毒力、疾病的性質等，中性粒細胞含量的高低可直接反映炎癥的發展情況，而淋巴細胞是白細胞中參加機體免疫功能的最重要的成分，根據其表面抗原、受體及功能等不同，淋巴細胞可分為T細胞和B細胞，T細胞介導細胞免疫，B細胞介導體液免疫。本試驗結果提示，ASPS可顯著增加外周血白細胞數量和淋巴細胞數量，對提高仔豬免疫力有一定的作用。

細胞因子在免疫調節中起重要作用。IL-2和IFN-γ可由Th1型T細胞分泌，主要促進T細胞增殖、介導細胞免疫和炎癥反應。IL-4主要由Th2型T細胞分泌，參與B細胞增殖以及體液免疫[12]。IL-2、IFN-γ 的大量分泌可以下調體液免疫應答。而IL-4、白細胞介素-10(IL-10)等細胞因子可下調細胞免疫應答[13-14]。以往關于ASPS影響細胞因子分泌的研究表明，ASPS對S801白血病細胞系具有促誘生IFN-γ的效應[15];能明顯增強細胞毒T細胞殺傷靶細胞的活性，并能促進刀豆球蛋白(ConA)刺激的小鼠脾細胞分泌IL-2[16];10 mg/L ASPS對人淋巴細胞在ConA刺激下所產生的IFN-α或IFN-γ的效價均比常規誘生組高5～7倍，是理想的干擾素促誘生劑[17]。本試驗結果表明，ASPS可顯著促進IL-2、IFN-γ分泌，而對血清IL-4含量影響不顯著，這與上述以往的研究結果一致。另外，從本試驗結果還可看出，ASPS提高仔豬外周血白細胞數量、淋巴細胞數量，促進IL-2和IFN-γ分泌存在劑量依賴關系，當劑量為500～1 000 mg/kg時，能顯著或極顯著提高仔豬外周血白細胞數量、淋巴細胞數量，促進IFN-γ分泌，800 mg/kg的ASPS能顯著促進IL-2分泌，而當劑量低于500 mg/kg時，這種影響作用并不顯著。上述結果提示ASPS可能是通過促進IL-2和IFN-γ的分泌而提高機體的免疫功能的。

在ASPS影響機體的體液免疫方面，以往有以小鼠為對象的研究報道，指出ASPS可顯著增強小鼠脾分泌IgM的脾臟抗體形成細胞(plaque forming cell，PFC)，100 mg/kg ASPS 可顯著增強小鼠脾分泌IgG的PFC和小鼠對牛血清蛋白誘導的遲發型超敏反應性[18]。從刺五加組織培養的果實中分離獲得的果多糖可顯著增加分泌IgM的B細胞數量[7]。這些基礎研究均指明了ASPS對小鼠體液免疫功能也具有調節作用。而本試驗指出ASPS對IL-4分泌及血清IgA、IgM、IgG抗體水平(血清免疫球蛋白含量或效價高低是反映機體體液免疫水平的重要指標，其含量或效價越高表示機體的體液免疫水平越高)影響均不顯著，提示ASPS可能對仔豬體液免疫功能無顯著影響，這與上述的以往研究結果不一致，分析這種結果的差異可能是研究動物小鼠和仔豬的種屬差異所致。

4 結論

①ASPS能劑量依賴性地增加仔豬外周血白細胞數量和淋巴細胞數量，促進血清細胞因子IL-2、IFN-γ分泌，對仔豬的免疫功能有改善作用。

②ASPS促進細胞因子IL-2和IFN-γ的分泌可能是提高仔豬免疫功能的因素之一。

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