博落回提取物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)豬應(yīng)激細(xì)胞應(yīng)激參數(shù)及免疫球蛋白G和超氧化物歧化酶mRNA表達(dá)的影響

滿 意 張春勇 陳克嶙 李美荃 郭榮富

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

近年來(lái)抗生素使用的弊端日益嚴(yán)重，針對(duì)抗生素藥物殘留和耐藥性問(wèn)題，研究和應(yīng)用新型抗生素替代品已成為重要課題內(nèi)容。博落回(M.cordata)在動(dòng)物生產(chǎn)中，具有廣譜清熱解毒消腫、抗菌等作用。而博落回提取物(MC extracts)是從罌粟科博落回屬植物博落回或小果博落回(M.microcarpa)植株中提取出來(lái)的生物堿，作為安全新型抗生素替代品在畜牧業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。經(jīng)過(guò)前期發(fā)現(xiàn)，添加適宜濃度博落回提取物對(duì)仔豬具有明顯的促生長(zhǎng)作用，進(jìn)一步研究博落回提取物是否可作為仔豬免疫和抗氧化調(diào)節(jié)劑具有重要科學(xué)意義。研究表明，博落回提取物中主要含有苯并菲啶類生物堿血根堿和白屈菜紅堿，博落回提取物中的血根堿與白屈菜紅堿具有抑菌、抗腫瘤細(xì)胞增殖、保護(hù)肝臟、殺蟲等作用[1-4]，博落回在歐盟是允許添加的飼料添加劑之一。Vieira等[5]報(bào)道，在火雞飼糧中添加含有博落回提取物的飼料添加劑，結(jié)果表明添加32.8 mg/kg博落回提取物能提高火雞采食量，在35日齡時(shí)有最大的飼料轉(zhuǎn)化率。饒華等[6]研究表明，血根堿和博落回提取物均能顯著提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，有效緩解了斷奶應(yīng)激。滿意[7]研究表明，博落回提取物顯著改善仔豬生產(chǎn)性能、免疫性能和抗氧化能力，仔豬飼糧適宜添加量為4.5 mg/kg。生物堿是存在于自然界中的一類含氮的堿性有機(jī)化合物，有顯著的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一，生物堿具有提高機(jī)體免疫力和抗氧化能力的作用，但其作用機(jī)制仍不清楚，對(duì)博落回提取物是否通過(guò)影響動(dòng)物相關(guān)基因表達(dá)而改善機(jī)體免疫性能和抗氧化能力的研究資料很少，迄今為止，博落回提取物對(duì)豬免疫球蛋白G(IgG)和超氧化物歧化酶(SOD)mRNA表達(dá)影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過(guò)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)豬細(xì)胞以建立應(yīng)激細(xì)胞模型，檢測(cè)細(xì)胞應(yīng)激參數(shù)的變化，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，研究博落回提取物對(duì)豬應(yīng)激和正常細(xì)胞IgG和SOD mRNA表達(dá)的影響，探討博落回提取物對(duì)豬細(xì)胞內(nèi)源IgG、SOD mRNA的誘導(dǎo)作用，為博落回提取物對(duì)豬抗病營(yíng)養(yǎng)作用機(jī)理的研究提供新的試驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬胚胎背部皮膚成纖維細(xì)胞為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室冷凍保存。

本試驗(yàn)使用博落回提取物總生物堿含量≥60%，其中含血根堿45%、白屈菜紅堿19%[7]。土霉素為廣州中邦生物科技有限公司產(chǎn)品。

基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液)、胎牛血清、青霉素 -鏈霉素雙抗、胰酶，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;LPS購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;IgG含量采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè);乳酸脫氫酶、溶菌酶、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;總RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(PrimeScripRT Reagent Kit with gDNA Eraser)及熒光定量PCR試劑盒(SYBPremix Ex TaqTMⅡ)均購(gòu)自日本TaKaRa公司。

利用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast工具確認(rèn)引物的特異性，選用在豬機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的3個(gè)基因β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)、甘油醛 -3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、TATA框結(jié)合蛋白(TATA box binding protein，TBP)作為看家基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列及參數(shù)見(jiàn)表1。

1.2 LPS對(duì)細(xì)胞的抑制率的檢測(cè)

采用6孔板和基礎(chǔ)培養(yǎng)液細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μL，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1 000～10 000個(gè)/孔。5%CO2、37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底。加入LPS使其終濃度為 5、10、15 μg/mL，每個(gè)處理 3 個(gè)重復(fù)，每孔為1個(gè)重復(fù)。5%CO2、37℃孵育12～48 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μL甲基噻唑基四唑(MTT)溶液(5 mg/mL，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量吸光度(OD)值，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基+MTT+二甲基亞砜)和對(duì)照孔(細(xì)胞+相同濃度的藥物溶解介質(zhì)+培養(yǎng)基+MTT+二甲基亞砜)。觀察細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞的抑制率。

細(xì)胞的抑制率(%)=100×(對(duì)照孔OD-培養(yǎng)后細(xì)胞OD)/對(duì)照孔OD。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后，傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶時(shí)進(jìn)行以下處理。

LPS溶解于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中至終濃度為10 μg/mL，培育12 h后得到LPS應(yīng)激細(xì)胞。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，正常細(xì)胞和應(yīng)激細(xì)胞分別進(jìn)行處理，對(duì)照組采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液，土霉素組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加土霉素50 μg/mL(陽(yáng)性對(duì)照組)，博落回組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別添加50、100、150 ng/mL的博落回提取物。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，1個(gè)孔為1個(gè)重復(fù)。各組細(xì)胞在37℃的條件下培養(yǎng)24 h后，收集各孔細(xì)胞液，3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃冰箱保存待測(cè)。所有樣品參測(cè)細(xì)胞的抑制率、IgG和SOD mRNA表達(dá)量;應(yīng)激細(xì)胞上清液進(jìn)行應(yīng)激參數(shù)的檢測(cè)。

表1 引物序列及參數(shù)Table1 Sequences and parameters of primers

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table2 The experimental design

1.4 應(yīng)激參數(shù)的檢測(cè)

嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IgG、溶菌酶、NO含量及NOS、乳酸脫氫酶的活性。

1.5 IgG和SOD mRNA表達(dá)量檢測(cè)

用常規(guī)方法提取細(xì)胞總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA抽提樣品完整性。所提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。

以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用Eva GreenⅠ染料法，反應(yīng)在Bio-RadCFX 96TMReal-TimePCR Systems上進(jìn)行。反應(yīng)體系為 20μL:SsoFastTMEvaGREESupermix(Bio-Rad，美國(guó))10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 1.0 μL，cDNA 模板2.0 μL，加滅菌去離子水至 20 μL。樣品分裝于96孔板(Bio-Rad，美國(guó))中，將可透光蓋(Bio-Rad，美國(guó))蓋緊。反應(yīng)條件為:95℃、10 s;95℃、5 s，59℃、20 s，72℃、15 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件處理和方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，進(jìn)行二次回歸分析，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 LPS對(duì)細(xì)胞的抑制率

在添加 LPS 使其終濃度為 5、10、15 μg/mL后，觀察細(xì)胞形態(tài)，正常細(xì)胞(圖1-A)和應(yīng)激細(xì)胞(圖1-B)形態(tài)差異不大，但是應(yīng)激細(xì)胞間隙有所增大。加入博落回提取物后，細(xì)胞繼續(xù)正常生長(zhǎng)(圖1-C)，未加入博落回提取物的細(xì)胞因過(guò)度免疫應(yīng)激而死亡，形態(tài)發(fā)生改變(圖1-D)。不同濃度LPS在不同時(shí)間段對(duì)細(xì)胞的抑制率見(jiàn)表3，本次試驗(yàn)條件下LPS最適宜濃度和培養(yǎng)時(shí)間分別為10 μg/mL 和 12 h。

圖1 LPS和博落回提取物對(duì)細(xì)胞的形態(tài)的影響Fig.1 Effects of LPS and MC extracts on cell modalities

表3 不同濃度LPS在不同時(shí)間段對(duì)細(xì)胞的抑制率Table3 Inhibition rates of different concentrations of LPS on cells at different time points %

2.2 博落回提取物對(duì)豬LPS應(yīng)激細(xì)胞應(yīng)激參數(shù)的影響

由表4可見(jiàn)，經(jīng)LPS刺激，在加入不同濃度博落回提取物之后，細(xì)胞培養(yǎng)液中IgG含量極顯著高于對(duì)照組和土霉素組(P＜0.01);土霉素組細(xì)胞培養(yǎng)液中IgG含量極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。博落回組細(xì)胞培養(yǎng)液中溶菌酶含量極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);土霉素組與150 ng/mL博落回組溶菌酶含量差異不顯著(P＞0.05)，但是這2組溶菌酶含量顯著高于50和100 ng/mL博落回組(P＜0.05)。博落回組與土霉素組細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，50 ng/mL博落回組細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性顯著低于另外2個(gè)博落回組及土霉素組(P＜0.05)。博落回組NO含量及NOS活性極顯著高于對(duì)照組和土霉素組(P＜0.01)。

表4 博落回提取物對(duì)豬LPS應(yīng)激細(xì)胞應(yīng)激參數(shù)的影響Table4 Effects of MC extracts and oxytetracycline on stress parameters of cells challenged by LPS in pigs

2.3 博落回提取物對(duì)豬LPS應(yīng)激細(xì)胞IgG和SOD mRNA表達(dá)量的影響

2.3.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物

由圖2可見(jiàn)，其18S、28S條帶清晰，無(wú) DNA污染條帶，無(wú)明顯降解條帶。所提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè) OD260nm/OD280nm在6～10，純度較高。

圖2 總RNA提取瓊脂糖電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of extracted total RNA

由圖3可見(jiàn)，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、明亮、無(wú)雜帶，說(shuō)明引物可以特異性地?cái)U(kuò)增出目的產(chǎn)物。

2.3.2 博落回提取物對(duì)豬LPS應(yīng)激細(xì)胞IgG mRNA表達(dá)量的影響

由圖4可見(jiàn)，對(duì)正常細(xì)胞而言，博落回組和土霉素組IgG mRNA表達(dá)量均有極顯著的提高(P＜0.01)，博落回組提高程度極顯著高于土霉素組(P＜0.01)。對(duì)應(yīng)激細(xì)胞而言，與對(duì)照組相比，50 ng/mL博落回組IgG mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.91倍(P＜0.01)，100 ng/mL博落回組是對(duì)照組的1.85倍(P＜0.01)，150 ng/mL博落回組是對(duì)照組的1.82倍(P＜0.01)，但3個(gè)博落回組間差異不顯著(P＞0.05)。土霉素組IgG mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.65倍(P＜0.01)。博落回組細(xì)胞中IgG mRNA表達(dá)量均極顯著高于土霉素組(P＜0.01)。應(yīng)激細(xì)胞與正常細(xì)胞之間比較，應(yīng)激細(xì)胞IgG mRNA表達(dá)量均高于正常細(xì)胞，對(duì)照組和100 ng/mL博落回組應(yīng)激細(xì)胞與正常細(xì)胞差異極顯著(P＜0.01)，50和100 ng/mL博落回組以及土霉素組應(yīng)激細(xì)胞與正常細(xì)胞差異顯著(P＜0.05)。

圖3 反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of the RT-PCR

圖4 博落回提取物對(duì)豬LPS應(yīng)激細(xì)胞IgG mRNA表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of MC extracts on IgG mRNA expression level of LPS challenged cells in pigs

2.3.3 博落回提取物對(duì)豬LPS應(yīng)激細(xì)胞SOD mRNA表達(dá)量的影響

由圖5可見(jiàn)，對(duì)正常細(xì)胞而言，博落回組和土霉素組SOD mRNA表達(dá)量均有極顯著的提高(P＜0.01)，土霉素組提高程度極顯著高于博落回組(P＜0.01)。對(duì)應(yīng)激細(xì)胞而言，50 ng/mL博落回組SOD mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.39倍(P＜0.01)，150 ng/mL博落回組是對(duì)照組的1.40倍(P＜0.05)，100 ng/mL博落回組是對(duì)照組的1.32倍(P＜0.05)。但3個(gè)博落回組間差異不顯著(P＞0.05)。土霉素組SOD mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.69倍(P＜0.01)。

應(yīng)激細(xì)胞與正常細(xì)胞之間比較，對(duì)照組、50 ng/mL博落回組和土霉素組應(yīng)激細(xì)胞SOD mRNA表達(dá)量極顯著高于正常細(xì)胞(P＜0.01)，100和150 ng/mL博落回組應(yīng)激細(xì)胞SOD mRNA表達(dá)顯著高于正常細(xì)胞(P＜0.05)。

對(duì)于應(yīng)激細(xì)胞與正常細(xì)胞，土霉素組SOD mRNA表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照組及博落回組(P＜0.01)。

圖5 博落回提取物對(duì)豬LPS應(yīng)激細(xì)胞SOD mRNA表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of MC extracts on SOD mRNA expression level of LPS challenged cells in pigs

3 討論

3.1 豬LPS應(yīng)激細(xì)胞的應(yīng)激參數(shù)的變化

血液免疫球蛋白濃度是仔豬免疫性能和健康的重要標(biāo)識(shí)之一。IgG具有免疫替代和免疫調(diào)節(jié)的雙重治療效果[8]。人們?cè)噲D通過(guò)多種途徑來(lái)改變仔豬血液IgG濃度，從改善仔豬免疫性能和抗病力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)液中博落回組IgG含量極顯著高于對(duì)照組和土霉素組(P＜0.01)，土霉素組也極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，說(shuō)明博落回提取物和土霉素均能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IgG，但博落回提取物增加IgG含量效果顯著優(yōu)于土霉素(P＜0.01)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加博落回提取物和土霉素均極顯著提高了溶菌酶含量(P＜0.01)，可能緩解細(xì)胞免疫應(yīng)激損傷。乳酸脫氫酶存在于組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，乳酸脫氫酶釋放與細(xì)胞膜通透性和完整性有關(guān)，且釋放量與細(xì)胞受損程度呈正相關(guān)，故可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性變化評(píng)定博落回提取物和土霉素是否損傷及損傷的程度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，博落回組(50、100 ng/mL)及土霉素組細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性均極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，說(shuō)明對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損傷或者損傷不大。有研究表明，通過(guò)減少白細(xì)胞來(lái)促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生，能保護(hù)腸道免受炎癥損傷[9]。iNOS基因在受到細(xì)胞因子或LPS刺激時(shí)才表達(dá)，iNOS基因表達(dá)能催化合成大量的NO。LPS能刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 NO[10]，簡(jiǎn)華剛等[11]報(bào)道，LPS 劑量在 0.001 ～0.100 μg/mL時(shí)，體外培養(yǎng)大鼠肺微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的量隨LPS劑量的增加而增多，但當(dāng)LPS劑量大于1 μg/mL，其含量不再增加。在本試驗(yàn)條件下，土霉素組細(xì)胞培養(yǎng)液NO含量和NOS活性極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，而不同濃度博落回組的細(xì)胞培養(yǎng)液NO含量和NOS活性均極顯著高于對(duì)照組和土霉素組(P＜0.01)，結(jié)果說(shuō)明，博落回提取物與緩解豬細(xì)胞應(yīng)激損傷有關(guān)。上述結(jié)果提示，適宜濃度博落回提取物作為營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)劑可以改善豬細(xì)胞應(yīng)激參數(shù)，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 博落回提取物對(duì)豬LPS應(yīng)激細(xì)胞IgG mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)

IgG是由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞產(chǎn)生的一種免疫球蛋白，是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，發(fā)揮著抗菌、抗病毒、抗毒素的免疫學(xué)效應(yīng)。IgG分泌細(xì)胞在口腔黏膜、胃腸道黏膜及生殖道均有存在[12-13]。IgG是動(dòng)物自然感染和人工主動(dòng)免疫后機(jī)體產(chǎn)生的主要抗體，是動(dòng)物機(jī)體抗感染的主力。在本試驗(yàn)中，應(yīng)激細(xì)胞中IgG mRNA表達(dá)量均高于正常細(xì)胞，應(yīng)激細(xì)胞中添加博落回對(duì)IgG mRNA表達(dá)量影響不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明博落回提取物能向上調(diào)節(jié)IgG mRNA表達(dá)，土霉素組與對(duì)照組相比表達(dá)量也有所提高(P＜0.01)。本試驗(yàn)中，IgG mRNA表達(dá)得到了增強(qiáng)，從而能產(chǎn)生更多的IgG抗體，增強(qiáng)體液免疫。

3.3 博落回提取物對(duì)豬LPS應(yīng)激細(xì)胞SOD mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)

生物堿具有抗氧化能力，生物堿能清除羥自由基使其能具有抗突變和抗基因毒性的作用[14]。SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶一起構(gòu)成體內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)，保護(hù)細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)的核酸免受自由基的攻擊。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，添加不同濃度博落回提取物和土霉素均能極顯著提高細(xì)胞中SOD mRNA的表達(dá)量(P＜0.01)，博落回提取物向上調(diào)節(jié)SOD mRNA表達(dá)的能力低于土霉素，而博落回提取物各濃度之間差異不顯著(P ＞0.05)。Slunská 等[15]通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，血根堿、白屈菜黃堿、血根黃堿、白屈菜紅堿不會(huì)增加細(xì)胞活性氧族產(chǎn)量，并能降低過(guò)氧化氫(H2O2)含量引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，顯示出具有抗氧化作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，博落回提取物能誘導(dǎo)SOD mRNA表達(dá)，改變SOD活性，結(jié)果可能影響豬應(yīng)激細(xì)胞的抗氧化能力。其作用機(jī)理仍有待研究。

4 結(jié)論

博落回提取物可提高LPS應(yīng)激細(xì)胞IgG、NO和LSZ的含量及NOS活性，提高應(yīng)激細(xì)胞和正常細(xì)胞IgG和SOD mRNA的表達(dá)量，總體效果優(yōu)于土霉素，較好的添加濃度為50～100 ng/mL。

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