仿生法評定幾種豬常用植物性飼料原料磷體外透析率

莊曉峰 陳 亮 張宏福 趙 峰 盧慶萍 薩仁娜 李東衛(wèi) 何科林

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

作為一種非再生資源，磷在飼料工業(yè)中具有舉足輕重的地位，是繼蛋白質(zhì)和能量之外的第3昂貴的飼料原料[1-4]。生產(chǎn)上為避免動物磷營養(yǎng)缺乏，往往向飼料中添加大量無機(jī)磷酸鹽，既增加了飼料成本，也導(dǎo)致磷的過量排泄和對環(huán)境的嚴(yán)重污染[5-8]。因此，準(zhǔn)確評定飼料磷的生物學(xué)效價對減少磷資源浪費(fèi)、降低環(huán)境污染等都具有重要意義。體內(nèi)法評定飼料磷生物學(xué)效價的結(jié)果雖然客觀可靠，但耗時、耗力、耗資，且條件難以控制、重復(fù)性差[9]，很難滿足實際需求。而體外法由于快速、簡便、費(fèi)用低等優(yōu)點，越來越受到營養(yǎng)學(xué)家的關(guān)注。迄今，體外法評定飼料磷透析率的方法有試管法和透析管法。試管法由于密閉酶促反應(yīng)環(huán)境中消化產(chǎn)物對酶促反應(yīng)的抑制而遭病詬;透析管法則常將試管等容器中模擬胃的消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)入透析袋中進(jìn)行小腸段模擬[10-14]，胃和小腸階段之間涉及樣品的轉(zhuǎn)移過程，增加了試驗誤差。針對傳統(tǒng)的體外消化法，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室開發(fā)出了單胃動物仿生消化系統(tǒng)，克服了傳統(tǒng)體外消化法在消化過程中無法實現(xiàn)產(chǎn)物實時分離的缺陷，使用實時動態(tài)的消化產(chǎn)物分離技術(shù)，通過計算機(jī)自動控制體外消化過程，基本排除了由于人工操作引入的系統(tǒng)誤差，提高了試驗結(jié)果的重演性[15-16]。本試驗利用SDS-Ⅰ型仿生消化系統(tǒng)，參考Liu等[11]測定飼料磷體外透析率的操作，在前期關(guān)于不同截留分子質(zhì)量(MWCO)透析袋對仿生消化法評定飼料總磷體外透析率影響研究的基礎(chǔ)上[17]，探討消化殘渣總磷測定法和透析液無機(jī)磷測定法評定飼料原料磷體外透析率的可行性，為確立仿生消化法評定豬飼料磷體外透析率的適宜操作規(guī)程提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用玉米、豆粕、菜籽粕、麥麩、米糠5種豬常用飼料原料，其磷含量如表1所示，用四分法取樣后粉碎過40目篩，-20℃儲存?zhèn)溆谩WCO為14 000和3 500 u的透析袋購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司(美國Viskase公司進(jìn)口分裝)。

表1 飼料原料的磷含量(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table1 Phosphorus content of feed ingredients(DM basis) %

1.2 試驗設(shè)計

試驗1參考Liu等[11]評定飼料磷體外透析率的操作，選用美國ViskasMWCO為14 000和3 500 u的透析袋進(jìn)行試驗，仿生消化結(jié)束后分別測定玉米、豆粕、麥麩消化殘渣中總磷及透析液中無機(jī)磷含量，每個樣品4個重復(fù)。

試驗2參考Liu等[11]評定飼料磷體外透析率的操作，選用美國ViskasMWCO為14 000和3 500 u的透析袋，通過測定仿生消化透析液中的無機(jī)磷含量，評定玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麥麩的磷體外透析率，每個樣品4個重復(fù)。

1.3 透析袋的處理

1.4 透析液的配制

在39℃下配制pH 6.44的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液作為小腸階段透析液，每瓶透析液體積精確為1 L，并加入160×104U青霉素鉀防止微生物的生長。

1.5 仿生消化系統(tǒng)操作過程

仿生消化時間及操作方法參考Liu等[11]評定飼料磷體外透析率的試驗，胃和小腸段消化時間分別設(shè)置為75和240 min。具體操作為:準(zhǔn)確稱取1.000 0 g飼料原料(精確至0.000 2 g)于10 mL玻璃試管中，同時測定干物質(zhì)含量，用20 mL模擬胃液(含1 475.0 U/mL胃蛋白酶)將飼料樣品完全轉(zhuǎn)移至裝好透析袋的仿生消化管中。把消化管置于仿生消化系統(tǒng)中，開始試驗。胃階段消化結(jié)束后，用加酶器在每個消化管中分別加入2 mL NaHCO3溶液(調(diào)節(jié)pH為6.44)及2 mL豬模擬小腸液，使食糜中含69.10 U/mL胰蛋白酶(Amresco)、8.68 U/mL糜蛋白酶(Amresco)、221.43 U/mL淀粉酶(Sigma)，然后接通透析液管道，讓小腸段透析液循環(huán)流過仿生消化管，每排5個消化管的透析液作為1個重復(fù)。待樣品消化結(jié)束后，準(zhǔn)確移取10 mL緩沖溶液瓶中的透析液于50 mL容量瓶中，采用鉬黃比色法測定其中無機(jī)磷含量[18]，計算透析液中無機(jī)磷總量。同時用去離子水將透析袋中的消化液和殘渣無損失的轉(zhuǎn)移至150 mL的燒杯中，65℃條件下烘至無水痕后，測定殘渣總磷含量[18]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SAS 8.0的MEANS模塊對基本統(tǒng)計量進(jìn)行分析，按平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;并對不同處理條件下測定結(jié)果進(jìn)行成組法t檢驗或配對法t檢驗。其中數(shù)據(jù)計算公式如下:

消化殘渣總磷測定法測得飼料總磷體外透析率(%)=100×[1-P3/(M0×DM0×P1)];

透析液無機(jī)磷測定法測得飼料磷體外透析率(%)=100×[P2/(M0×DM0×P1)]。

式中:M0為飼料樣品重(g);DM0為飼料樣品干物質(zhì)含量(%);P1為飼料樣品總磷含量(%，絕干基礎(chǔ));P2為透析液中無機(jī)磷含量(g);P3為消化殘渣總磷含量(g)。

2 結(jié)果

2.1 不同MWCO透析袋條件下豬飼料原料總磷體外透析率及透析液中無機(jī)磷和有機(jī)磷比率

由表2和表3可知，MWCO 14 000 u透析袋條件下測得玉米、豆粕、麥麩總磷體外透析率分別為42.91%、48.41%和86.13%，有機(jī)磷比率分別為58.56%、61.74%和7.33%。MWCO 3 500 u透析袋條件下測得飼料原料總磷體外透析率分別為17.23%、28.04%和78.24%，有機(jī)磷比率分別為27.22%、50.11%和 1.46%，相比 MWCO 14 000 u透析袋條件下有機(jī)磷透過量已降低，但仍然沒有將有機(jī)磷完全截留，沒有達(dá)到無機(jī)磷與有機(jī)磷的有效分離。

表2 MWCO 14 000 u透析袋條件下豬飼料原料總磷體外透析率及透析液中無機(jī)磷和有機(jī)磷比率Table2 Total phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients and inorganic and organic phosphorus ratios in dialysate using MWCO 14 000 u dialysis tubings %

表3 MWCO 3 500 u透析袋條件下豬飼料原料總磷體外透析率及透析液中無機(jī)磷和有機(jī)磷比率Table3 Total phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients and inorganic and organic phosphorus ratios in dialysate using MWCO 3 500 u dialysis tubings %

2.2 不同MWCO透析袋條件下透析液無機(jī)磷測定法測得飼料原料磷體外透析率

由表4可知，不同MWCO透析袋條件下，透析液無機(jī)磷測定法測得飼料原料磷體外透析率存在顯著差異(P＜0.05)。MWCO 14 000 u透析袋測得玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麥麩磷的體外透析率分別為17.78%、18.52%、34.77%、14.09%、79.82%，顯著高于MWCO 3 500 u透析袋測得結(jié)果(P＜0.05)，分別提高5.24%、4.53%、6.82%、1.63%、2.72%。飼料中的無機(jī)磷分子質(zhì)量極小，分析本試驗結(jié)果認(rèn)為，不同MWCO透析袋條件下飼料原料有機(jī)磷的降解率存在差異。

表4 不同MWCO透析袋條件下透析液無機(jī)磷測定法測得飼料原料磷體外透析率Table4 Phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients measured by inorganic phosphorus determination using different MWCO dialysis tubings %

2.3 仿生消化法測定豬飼料原料磷體外透析率的精度

由表5可知，MWCO 14 000 u透析袋條件下，透析液無機(jī)磷測定法測得玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麥麩的磷體外透析率分別為(17.78±0.28)%、(18.52±0.32)%、(34.77±0.55)%、(14.09±0.45)%、(79.82±0.69)%，重復(fù)間最大絕對偏差分別為 0.60%、0.79%、1.24%、0.88%、1.42%，變異系數(shù)為 1.56%、1.74%、1.59% 、3.22% 、0.86% 。

表5 MWCO 14 000 u透析袋條件下透析液無機(jī)磷測定法測得飼料原料磷體外透析率Table5 Phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients measured by inorganic phosphorus determination using MWCO 14 000 u dialysis tubings %

由表6可知，本試驗測定飼料磷體外透析率的變異系數(shù)均控制在4%以內(nèi)，低于Liu等[19]、方熱軍[12]的體外試驗及賈剛等[20]的體內(nèi)試驗測定結(jié)果的變異系數(shù)。從本試驗結(jié)果可知，與傳統(tǒng)體外消化試驗及體內(nèi)試驗相比，在SDS-Ⅰ型仿生消化系統(tǒng)上評定飼料磷體外透析率具有較好的試驗精度。

表6 不同研究者測定飼料磷體外透析率的變異系數(shù)的比較Table6 The coefficient of variation of phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients measured by different researchers %

3 討論

3.1 消化殘渣總磷測定法評定豬飼料原料磷體外透析率的可行性

植物性飼料中的磷以無機(jī)磷和有機(jī)磷(主要是植酸磷)2種形式存在。以無機(jī)鹽形式存在的磷在消化道溶解后可直接被動物吸收利用，而以有機(jī)化合物形式存在的磷必須經(jīng)酶水解釋放出無機(jī)磷后才能被動物吸收利用[21]，因此，消化殘渣總磷測定法評定飼料磷體外透析率的可行性取決于是否存在透析袋可將飼料中有機(jī)磷完全截留。前期關(guān)于不同透析袋對仿生消化法評定豬飼料干物質(zhì)和磷體外透析率影響的研究表明，美國ViskasMWCO 3 500 u透析袋條件下，消化殘渣總磷測定法測得飼料磷體外透析率最低且最接近報道的體內(nèi)結(jié)果[17]。本試驗通過測定飼料消化殘渣中總磷含量及透析液中無機(jī)磷含量，對MWCO 3 500 u透析袋分離無機(jī)磷與有機(jī)磷的有效性進(jìn)行研究。

MWCO 3 500 u透析袋條件下測得玉米、豆粕、麥麩總磷透析率分別為17.23%、28.04%、78.24%，顯著低于MWCO 14 000 u透析袋條件下測定結(jié)果，分別降低25.68%、20.37%、7.89%。透析袋MWCO降低，仿生消化透析液中無機(jī)磷和有機(jī)磷透析量均有所下降，但從無機(jī)磷和有機(jī)磷所占比例可以看出，有機(jī)磷透析量的降低對飼料總磷透析率的降低起了主要作用。MWCO 3 500 u透析袋條件下測得玉米、豆粕、麥麩透析液中有機(jī)磷比率分別為27.22%、50.11%和1.46%，相比14 000 u透析袋條件下有機(jī)磷透過量已降低，但是仍有部分有機(jī)磷通過透析袋進(jìn)入到透析液中。MWCO 3 500 u透析袋條件下通過測定消化殘渣總磷含量評定飼料磷體外透析率，會將透析液中的部分有機(jī)磷認(rèn)定為可吸收磷，使測定結(jié)果偏高，因此，由于透析袋的限制，消化殘渣總磷測定法并不適用于飼料磷體外透析率的研究。

3.2 不同MWCO透析袋對透析液無機(jī)磷測定法評定飼料原料磷體外透析率的影響

迄今，關(guān)于飼料磷透析率的體外評定，國內(nèi)外動物營養(yǎng)學(xué)家都有諸多報道。大多數(shù)研究者選用MWCO 12 000～14 000 u的透析袋，通過測定透析液中無機(jī)磷含量評定飼料磷體外透析率，但關(guān)于透析袋孔徑是否對飼料磷透析率存在影響尚未見報道。本試驗選用MWCO 14 000和3 500 u的透析袋，利用仿生消化系統(tǒng)評定了5種豬常用飼料原料磷體外透析率。

從本試驗結(jié)果可知，MWCO 14 000 u透析袋條件下測得玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麥麩磷的透析率均顯著高于MWCO 3 500 u透析袋測定結(jié)果，分別提高 5.24%、4.53%、6.82%、1.63%、2.72%。根據(jù)植酸分子結(jié)構(gòu)，其含有12個可解離的質(zhì)子，這些位點可以與蛋白質(zhì)、氨基酸、淀粉和脂質(zhì)等物質(zhì)上的陽離子基團(tuán)結(jié)合，以植酸復(fù)合物的形式存在，而飼料中的無機(jī)磷分子質(zhì)量很小。Newkirk等[22]研究報道植酸酶與植酸結(jié)合受到植物組織中其他組分不同程度的阻礙作用。Zyla等[10]報道，非淀粉多糖酶與植酸酶之間存在協(xié)同作用，也進(jìn)一步證明了這個問題。分析本試驗結(jié)果認(rèn)為，MWCO 3 500 u透析袋條件下飼料有機(jī)磷的降解率低于MWCO 14 000 u透析袋。其原因是采用MWCO 3 500 u透析袋進(jìn)行試驗，蛋白質(zhì)、淀粉等的酶解產(chǎn)物無法及時透析出去，對酶促反應(yīng)的抑制作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)等降解率降低，從而導(dǎo)致植酸磷無法暴露出來與植酸酶結(jié)合，無機(jī)磷透析率降低。由于麥麩較高的內(nèi)源植酸酶活性，本試驗測得其磷體外透析率達(dá)到了79.82%，是否存在其他原因還需要進(jìn)一步的研究。結(jié)合本試驗結(jié)果，建議透析液無機(jī)磷測定法評定飼料磷體外透析率時采用MWCO為14 000 u的透析袋，這也與Zyla 等[10]、方熱軍[12]、左建軍[13]、Liu 等[19]、張鐵鷹[23]的報道一致。

3.3 透析液無機(jī)磷測定法評定豬飼料原料磷體外透析率的可行性

關(guān)于飼料磷體外透析率的研究，大部分研究者的操作步驟為:飼料樣品與胃蛋白酶鹽酸溶液混合于10 mL試管中，恒溫水浴培養(yǎng)固定時間;胃階段消化結(jié)束后，向上述試管中加入固定體積的含有胰蛋白酶的NaHCO3溶液，并轉(zhuǎn)移至MWCO 12 000～14 000 u的透析袋中于固定體積的緩沖溶液中恒溫透析，結(jié)果測定透析液中的無機(jī)磷含量計算飼料磷體外透析率。本試驗在仿生消化系統(tǒng)的基礎(chǔ)上對以前研究者的操作稍作改動，胃階段即在透析袋中進(jìn)行，消化結(jié)束后，通過加酶器在透析袋中加入調(diào)節(jié)pH的NaHCO3溶液及小腸模擬消化酶，有效消除了消化殘渣轉(zhuǎn)移過程的系統(tǒng)誤差;小腸階段采用循環(huán)緩沖溶液進(jìn)行透析，有效避免了反應(yīng)體系可能存在的飽和問題。

體外消化試驗是通過模擬動物消化道環(huán)境條件來進(jìn)行，但是消化道中的酶是一個復(fù)雜多變的多酶系統(tǒng)，且消化過程受到神經(jīng)、激素系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，體外條件下難以完全模擬[24]，所以在體外模擬消化試驗上更應(yīng)注重體外試驗法的精確度、可重復(fù)性和可靠性。本試驗測得飼料磷體外透析率的變異系數(shù)均控制在4%以內(nèi)，低于Liu等[19]、方熱軍[12]的體外試驗及賈剛等[20]的體內(nèi)試驗測定結(jié)果的變異系數(shù)。由此可得，在SDS-Ⅰ型仿生消化系統(tǒng)上，透析液無機(jī)磷測定法能夠?qū)崿F(xiàn)飼料磷體外透析率的研究。

4 結(jié)論

①M(fèi)WCO 3 500 u透析袋條件下，飼料有機(jī)磷仍可通過透析袋進(jìn)入到透析液中，因此消化殘渣總磷測定法不適宜于飼料磷體外透析率的研究。

②采用透析液無機(jī)磷測定法評定飼料磷體外透析率，MWCO 14 000 u透析袋測得結(jié)果顯著高于3 500 u透析袋，且試驗精度優(yōu)于傳統(tǒng)體外方法，因此，MWCO 14 000 u透析袋條件下的透析液無機(jī)磷測定法更適宜于飼料磷體外透析率的研究。

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