急性內毒素損傷對奶山羊肝臟營養代謝的影響

王林楓 趙志偉 楊改青 王月影 朱河水 韓立強 張 震 楊國宇*

(1.河南農業大學農業部動物生化與營養重點實驗室，鄭州 450002;2.平頂山市畜牧局，平頂山 467000;3.河南農業大學生命研究中心，鄭州 450002)

內毒素(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌(G-)細胞壁分解后釋放出的含脂多糖類物質[1]，可導致機體的熱源性反應。正常情況下，機體內少量LPS隨門靜脈血進入肝臟，與肝臟枯否細胞上的Toll樣受體4(TLR4)結合，啟動腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)、白細胞介素 -1β(IL-1β)等促炎癥因子的轉錄，進一步引起炎癥反應。少量的LPS刺激可以提高機體的免疫能力，當過量LPS進入肝臟則會引起強烈的炎癥反應，影響肝臟營養代謝并降低動物的免疫能力，嚴重的還會發生內毒素血癥[2]。研究報道，當動物發生內毒素血癥時，肝臟[3]、腎臟[4]、肺臟[5]等內臟器官受到嚴重的損傷。由此可見，肝臟是最易受LPS傷害的主要靶器官之一，但過量的LPS進入肝臟后對肝臟營養代謝的影響還未見報道。本試驗以奶山羊為研究對象，通過研究LPS所致急性肝臟損傷對肝臟營養物質代謝的影響，探索LPS對肝臟營養代謝的作用機制，為在生產中消除或減少LPS對動物健康和生產性能的影響提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組

選用健康、體況相近、年齡2.5～3.0歲、體重35～40 kg的關中奶山羊母羊18只，隨機分為3組，每組6只，分別作為對照組(CTL組)、試驗Ⅰ組(TⅠ組)和試驗Ⅱ組(TⅡ組)。

1.2 飼養管理及飼糧組成

試驗羊飼喂于代謝籠(專利號:2009203148043)內，單籠飼養，飼糧和飲水分別從料槽和水槽供給，定量飼喂，自由飲水。根據NRC(2007)[6]山羊飼養標準設計飼糧配方(表 1)，飼糧精粗料比為30∶70(干物質基礎)，干物質中粗蛋白質含量為13.21%。飼喂量按山羊體重的3%供給，預試期14 d。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table1 Composition and nutrient levels of the diet(air-dry basis)

1.3 試驗處理

試驗前對所有試驗羊稱重，并依據體重調整LPS注射液的濃度[試驗前預先把LPS配制成0.5 mg/mL的溶液，LPS購自Sigma公司，其組成為大腸桿菌(E.coli)055∶B5]。試驗開始時，TⅠ組、TⅡ組奶山羊分別按照100和200 μg/kg BW的劑量從頸靜脈注射不同濃度的LPS注射液30 mL，CTL組奶山羊注射相同體積的生理鹽水，詳細方法及劑量參考Dow等[7]。

1.4 血樣采集與處理

分別在注射 LPS 后 0、1、4、8、12、24 h 從奶山羊的頸靜脈采血，每次采血時用真空抗凝采血管采血5 mL，立即以3 000 r/min離心15 min(離心機型號:TDZS-WS，湘儀離心機廠)，分離血漿，置于EP管中，于-20℃保存待測。

1.5 指標測定及方法

肝臟代謝功能指標包括谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)，營養代謝指標包括葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HVDL)、總膽固醇(CHOL)、尿素氮(UN)。上述指標均采用全自動生化分析儀(Olympus AU640)檢測，ALT、AST測定試劑盒購自上海長征復星生物科技有限公司，其他指標測定試劑盒購自山東奧期幫生物科技有限公司。

1.6 數據統計分析

試驗數據用Excel 2007進行初步整理，應用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。用協方差分析校正初始值，用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間比較，以Duncan氏法進行多重比較，結果均以“平均值±標準差”表示。方差分析中，以P＜0.05為差異具有顯著性意義。

2 結果與分析

2.1 LPS對奶山羊肝臟代謝功能的影響

從表2可以看出，血漿ALT活性平均值表現為TⅠ組＞CTL組＞TⅡ組，且 TⅠ組顯著高于CTL組(P＜0.05)，CTL組顯著高于TⅡ組(P＜0.05)。從各時間點血漿ALT活性的變化趨勢來看，在各時間點均表現為TⅠ組＞CTL組＞TⅡ組，在6 h前的各時間點3組之間差異不顯著(P＞0.05);12 h時，TⅠ組明顯升高，TⅡ組和CTL組基本穩定，但各組之間仍差異不顯著(P＞0.05);24 h時，TⅠ組顯著高于TⅡ組和CTL組(P＜0.05)，TⅡ組和CTL組之間差異不顯著(P＞0.05)。

與血漿ALT活性不同，血漿AST活性平均值表現為TⅠ組＞TⅡ組＞CTL組，TⅠ組顯著高于TⅡ組和CTL組(P＜0.05)，但TⅡ組和 CTL組之間差異不顯著(P＞0.05)。從各時間點血漿ALT活性的變化趨勢來看，1 h后TⅠ組就明顯升高，并始終顯著高于TⅡ組和CTL組(P＜0.05)，而TⅡ組和CTL組在各時間點均差異不顯著(P＞0.05)。

表2 各組奶山羊血漿ALT、AST活性Table2 Plasma ALT and AST activities of dairy goats in different groups U/L

2.2 LPS對奶山羊肝臟糖代謝的影響

從表3可以看出，血漿GLU含量平均值表現為CTL組＞TⅡ組＞TⅠ組，但各組之間均差異不顯著(P＞0.05)。隨著時間的推移，CTL組血漿GLU含量基本穩定;TⅠ組和TⅡ組血漿GLU含量有較大的變化，表現為先升高，隨后迅速降低，6 h時2組都降至最低，以后緩慢回升，TⅠ組回升的速度高于TⅡ組，但2組之間差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 LPS對奶山羊肝臟蛋白質代謝的影響

由表4可以看出，血漿TP含量平均值表現為CTL組＞TⅡ組＞TⅠ組，TⅠ組和TⅡ組顯著低于CTL組(P＜0.05)，而TⅠ組和TⅡ組之間差異不顯著(P＞0.05)。從各時間點血漿TP含量的變化趨勢來看，CTL組基本穩定，各時間點變化不大;TⅠ組在6 h前持續降低，各時間點差異顯著(P＜0.05)，6 h后稍有回升，各時間點差異不顯著(P＞0.05);TⅡ組表現為先降低，后穩定，6 h時最低，顯著低于0和1 h時(P＜0.05)，6 h后基本穩定，各時間點差異不顯著(P＞0.05)。

表3 各組奶山羊血漿葡萄糖含量Table3 Plasma glucose content of dairy goats in different groups mmol/L

血漿ALB含量平均值表現為CTL組＞TⅠ組＞TⅡ組，但各組之間均差異不顯著(P＞0.05)。隨著時間的推移，CTL組血漿ALB含量基本穩定;TⅠ組和TⅡ組血漿ALB含量逐漸降低，TⅡ組降低的幅度大于TⅠ組，但2組之間差異不顯著(P＞0.05)。

血漿UN含量平均值表現為TⅡ組＞TⅠ組＞CTL組，CTL組顯著低于 TⅠ組和 TⅡ組(P＜0.05)，但TⅠ組和TⅡ組之間差異不顯著(P＞0.05)。隨著時間的推移，CTL組血漿UN含量基本穩定;TⅠ組和TⅡ組血漿LDL含量逐漸升高，1 h后顯著高于CTL組(P＜0.05)，TⅡ組升高的幅度大于TⅠ組，但除在3和12 h時差異顯著(P＜0.05)外，其他時間點均差異不顯著(P＞0.05)。

表4 各組奶山羊血漿蛋白質類及尿素氮含量Table4 Plasma protein and urea nitrogen contents of dairy goats in different groups

2.4 LPS對奶山羊肝臟脂肪代謝的影響

由表5可以看出，血漿TG含量平均值表現為TⅠ組＞TⅡ組＞CTL組，TⅠ組和TⅡ組顯著高于CTL組(P＜0.05)，而TⅠ組和TⅡ組之間差異不顯著(P＞0.05)。從各時間點血漿TG含量的變化趨勢來看，從1 h開始的各時間點TⅠ組、TⅡ組均顯著地高于CTL組(P＜0.05)，在各時間點TⅠ組均高于TⅡ組，且在3和6 h時達到顯著水平(P＜0.05)。

血漿LDL含量平均值表現為TⅠ組＞TⅡ組＞CTL組，TⅠ組顯著高于TⅡ組和 CTL組(P＜0.05)，而TⅡ組和CTL組之間差異不顯著(P＞0.05)。隨著時間的推移，TⅡ組血漿LDL含量基本呈下降趨勢，在個別時間點間達到顯著差異(P＜0.05);TⅠ組和CTL組血漿LDL含量在各時間點變化不顯著(P＞0.05)。

血漿HDL含量平均值表現為TⅠ組＞TⅡ組＞CTL組，TⅠ組顯著高于TⅡ組和 CTL組(P＜0.05)，TⅡ組顯著高于 CTL組(P＜0.05)。隨著時間的推移，TⅠ組血漿HDL含量表現為緩慢升高的趨勢，除個別時間點外，大多數時間點差異不顯著(P＞0.05);TⅡ組和CTL組血漿HDL含量在各時間點變化不顯著(P＞0.05)。

血漿CHOL含量平均值表現為TⅠ組＞TⅡ組＞CTL組，TⅠ組顯著高于TⅡ組和 CTL組(P＜0.05)，TⅡ組顯著高于CTL組(P＜0.05)。隨著時間的推移，CTL組血漿CHOL含量在各時間點變化不顯著(P＞0.05);TⅠ組血漿CHOL含量表現為先降低后升高的趨勢，6 h后開始升高，24 h時顯著高于其他各時間點時(P＜0.05);TⅡ組血漿CHOL含量表現為先升高后降低再升高的趨勢，6和12 h時較低，顯著低于1 h時(P＜0.05)，其他各時間點之間差異不顯著(P＞0.05)。

表5 各組奶山羊血漿中脂類的含量Table5 Plasma lipid contents of dairy goats in different groups mmol/L

3 討論

3.1 LPS對奶山羊肝臟代謝功能的影響

ALT是肝細胞中主要的代謝酶，是可逆地催化丙酮酸和谷氨酸之間氨基酸轉移的酶，以磷酸吡哆醛作為輔助因子。ALT主要存在于肝細胞漿，很少外泄，胞內濃度是血漿濃度的1 000～3 000倍，只有肝細胞受到損傷或壞死，才有大量ALT進入血液，引起血漿ALT活性升高，肝細胞壞死增加1%就可使血漿中ALT活性升高1倍。因此，ALT是反映肝功能損傷程度最敏感的指標之一。本試驗中，TⅠ組血漿ALT活性顯著高于CTL組，表明100 μg/kg BW 劑量的 LPS對肝細胞已造成明顯損傷;TⅡ組ALT活性低于CTL組，表明200 μg/kg BW劑量的LPS對肝臟已不具有損傷，證明LPS對肝臟的損傷與劑量有關，高劑量的LPS可減輕對肝臟的傷害，至于多高劑量時開始減輕，目前還未見研究報道。關于高劑量LPS對肝臟損傷降低的原因，目前的解釋是LPS對細胞的作用需通過LPS結合蛋白(LBP)介導與CD14(一種細胞因子，參與LPS的受體組成)形成復合物后才能夠與TLR4結合，激活下游信號通路，產生炎癥因子，損傷肝細胞。已研究表明，LBP的增敏效應與劑量有關，高劑量的LPS對LBP的增敏效應有抑制作用，抑制了LPS與CD14的結合，從而阻止了LPS所引起的炎癥反應，減輕了其對肝細胞的傷害[8]。此外，殺菌通透性增加蛋白(BPI)和HDL均可抑制LPS與受體的結合，降低其對肝細胞的損傷[9-10]。

AST是一種具有磷酸吡哆醛依賴性、由細胞核基因編碼的線粒體酶，催化天冬氨酸的氨基轉移到α-酮戊二酸形成草酰乙酸和谷氨酸及其逆反應。肝臟內的谷草轉氨酶有2種同工酶，分別存在于肝細胞的胞漿內(sAST)和線粒體內(mAST)。當肝細胞受損或任何原因引起肝細胞膜通透性增加時，位于肝細胞內的AST逸出細胞進入血液，使血漿AST活性增高[11]。在肝細胞輕度病變時，僅 sAST釋放入血;當病變嚴重時，mAST也會相繼釋放入血，故AST活性的高低可反映肝細胞的損傷程度和壞死量[12]。另有研究表明，mAST易于被網狀免疫系統清除，其清除率比sAST快5倍。若肝細胞急性損傷得以緩解，則血漿中mAST很快下降，甚至恢復到正常水平[13]。因此，mAST不僅作為判斷細胞壞死的指標，也是對肝臟疾病動態監測的指標[14]。本試驗中，TⅠ組、TⅡ組奶山羊血漿AST活性高于CTL組，表明TⅠ組、TⅡ組奶山羊的肝臟在LPS的作用下受到損傷;而TⅡ組AST活性低于TⅠ組，表明TⅡ組奶山羊的肝臟損傷有所緩和，證明LPS對肝臟的傷害與劑量有關。

3.2 LPS對肝臟糖代謝的影響

肝臟是反芻動物糖異生的重要器官，大量LPS進入機體以后，會造成急性肝功能衰竭內毒素血癥，同時刺激機體產生多種內源性介質和細胞因子，肝臟糖異生受到抑制，導致血糖含量降低[15]。但由于應激，在注射LPS后的短時間內血糖含量表現為升高，之后，隨著時間的延長，表現為低血糖癥狀。此外面，注射LPS后，由于LPS的毒性作用導致細胞缺血缺氧，細胞有氧代謝減弱，無氧酵解增強，對葡萄糖的需求增加，糖異生增強，使血糖含量在短時間內升高。隨著時間的推移，由于糖異生受到抑制，最終導致血糖含量降低[16]。本試驗中，注射LPS后血糖(血漿葡萄糖)含量表現出先升高后降低的趨勢，證明了上述結論。LPS抑制肝臟糖異生的分子機制有待進一步研究。

3.3 LPS對肝臟蛋白質代謝的影響

肝臟在蛋白質代謝過程中起重要作用，血漿內蛋白質幾乎全部由肝臟合成，TP主要包括ALB和球蛋白(GBL)，其中ALB占到40% ～60%。血漿ALB是機體各組織合成自身蛋白質的原料，是許多脂溶性物質的非特異性運輸載體，在維持血漿膠體滲透壓方面也起著重要作用，因此，血漿TP、ALB含量是反映肝臟健康狀況的重要指標。本試驗中，TⅠ組和TⅡ組TP、ALB含量不同程度地降低，表明肝臟受到損傷后合成蛋白質的能力減弱。

本試驗中，TⅠ組和TⅡ組的血漿UN含量升高，表明肝臟內蛋白質的分解增加，產生大量的尿素，在LPS中毒的情況下，奶山羊的采食量和消化活動受到很大影響，尿素循環和再利用減少，使血漿UN含量升高。腎臟是尿素的主要排泄器官。肝損傷后，腎臟的功能受到影響，氮的排泄受到影響。研究發現，LPS誘導后小鼠血清尿素的水平較誘導前顯著升高[17]。LPS引起腎功能損傷后，導致尿素排泄障礙，是血漿UN含量升高的另外一個重要原因[18]。本試驗中，奶山羊血漿UN含量隨著劑量的加大而升高，表明LPS對奶山羊腎臟功能的損傷與劑量呈正相關。

3.4 LPS對脂肪代謝的影響

研究表明，LPS促進脂肪酸氧化，使脂肪分解增強、血脂增高，從而引起肝臟脂代謝紊亂[19-20]。LPS及其他的炎癥因子，如TNF-α、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)等，通過刺激肝臟中富含TG的VLDL的釋放而使血漿TG含量升高[21];LPS通過降低脂蛋白酯酶(LPL)活性抑制其對TG的清除，炎癥也能減少血漿富含TG的脂蛋白的清除[22]。由于肝臟損傷，一方面，VLDL的合成和分泌減少，使血液中游離脂肪酸(FFA)的含量增多，導致大量的TG在肝臟內沉積;另一方面，肝臟內發生大量的氧化，肝臟損傷后其抗氧化能力減弱，大量的自由基在肝臟中蓄積，進一步加重了肝臟的損傷[22]。本試驗中，TⅠ組、TⅡ組血漿TG含量均高于CTL組，并隨時間延長逐漸升高，與上述研究結果相同;且血漿TG含量TⅡ組較TⅠ組有所下降，表明LPS對TG的升高作用與劑量有關，高劑量的LPS對TG的升高作用反而降低。

HDL和CHOL是肝臟脂肪代謝過程中的重要組成物質。膜轉運蛋白三磷酸腺苷結合盒轉運體(ABCA1)可將游離膽固醇從胞內流向胞外，與載脂蛋白AⅠ(ApoAⅠ)等結合形成HDL，逆向運回肝臟，在清除外周血膽固醇的過程中發揮作用。研究表明，LPS能干擾CHOL的逆轉運過程，通過抑制CHOL逆轉運相關蛋白干擾CHOL的逆轉運，造成細胞內 CHOL 積聚[22]。Ruan 等[23]研究證實，LPS可抑制ABCA1基因的表達，使細胞內CHOL含量升高;Castrillo等[24]證實，通過肝臟 X受體(LXR)和Toll樣受體(TLR)通路交互作用，LPS激活TLR4通路后抑制LXR通路，使巨噬細胞膜轉運蛋白ABCA1和載脂蛋白E(ApoE)的基因表達減少，減弱CHOL的逆轉運。研究表明，高脂負荷顯著下調卵磷脂膽固醇脂酰轉移酶(LCAT)mRNA的表達水平，導致血漿LCAT的活性降低，進而使HDL表面游離CHOL的酯化減少，降低了HDL對外周組織CHOL的清除能力，增加動脈粥樣硬化(AS)發生的可能性[25]。本試驗中，TⅠ組、TⅡ組CHOL含量升高可能是LPS干擾CHOL的逆向轉運，導致血液中CHOL無法正常運往肝臟而積聚，并導致HDL含量的上升。

HDL是將肝外組織的CHOL運送到肝臟的運載工具，可以防止游離CHOL在肝外組織細胞上的沉積。HDL主要在肝臟、小腸中合成，降解主要在肝臟中。HDL通過CHOL的逆向轉運，把外周組織中衰老細胞膜上以及血漿中的CHOL運回肝臟代謝，是脂代謝中的重要物質。據報道，各種脂蛋白，如 LDL、VLDL、HDL 和 VHDL，對 LPS 均有一定解毒作用，其中以HDL與LPS的結合能力最高，可有效地清除血液中的 LPS[8，26]。但不同劑量的LPS對其與HDL的親和力以及清除效率的影響，尚待進一步研究。

4 結論

①LPS可引起肝臟損傷，進而對奶山羊肝臟營養代謝造成影響。

②LPS對奶山羊肝臟營養代謝的影響與LPS的劑量有關。

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