樺木酸對小鼠免疫器官抗氧化能力的影響

易金娥 屠 迪 鄔 靜 袁 慧

(湖南農業大學動物醫學院，長沙 410128)

隨著現代飼養業集約化程度的不斷提高，氧化應激在畜禽生產中的危害已大量顯現，如何減少或緩解畜禽的氧化應激已成為現代養殖業的重大課題。一些具有抗氧化、清除自由基作用的植物源性免疫調節劑可望能有效地調控機體的氧化應激進程，進而保障機體細胞內外環境的平衡和生理機能健康。樺木酸(betulinic acid，BA)屬于羽扇豆烷型五環三萜類化合物，可從多種植物中分離得到，如樺木科、桃金娘科、鼠李科、五加科等，主要分布于樺木科樺木屬植物中，尤其以樺樹的外皮中最為豐富[1]。國外對BA的研究主要集中在抗腫瘤、抗艾滋病、抗菌以及其他藥理作用[2]方面，國內對BA的研究主要集中在對腫瘤細胞凋亡的影響[3-4]方面，而其對正常細胞的作用未見系統研究。BA對正常細胞或機體具有保護作用，該保護作用可能與抗氧化應激有一定的關系。BA能調控細胞周期調節蛋白，通過降低活性氧(ROS)的生成和核轉錄因子 -κB(NF-κB)的活性，抑制高糖誘導的人主動脈平滑肌細胞和人臍靜脈內皮細胞的增殖，并對血管具有保護作用，能有效預防動脈粥樣硬化[5-6]。BA對甲醇致肝星狀細胞損傷具有保護作用，如抗氧化作用，抑制細胞因子的分泌，抑制轉化生長因子 - β(TGF-β)、NF-κB、c-jun氨基末端激酶(JNK)信號轉導[7]。作者前期的研究發現，BA能激活小鼠腹腔巨噬細胞，提高其吞噬能力和能量代謝水平，增強機體抗氧化能力[8];進一步的研究發現，BA具有一定的免疫調節作用，對小鼠的細胞免疫、體液免疫和非特異免疫功能有明顯的增強作用[9-10]。BA藥理作用的發揮可能與提高機體的免疫能力和抗氧化應激有關，不一定直接作用于感染或腫瘤細胞。因此，本試驗擬采用體內給藥途徑，系統研究BA對小鼠免疫器官抗氧化能力的影響，為BA的抗氧化應激研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用BA是以白樺樹皮(2009年春季收集于波蘭弗羅茲瓦夫市，經60℃烘干后貯藏在黑暗、干燥處備用)為原料，按參考文獻[11]的方法在波蘭弗羅茲瓦夫環境與生命科學大學自制獲得。具體方法如下:稱取白樺樹皮粉末15 g，用200 mL甲醇70℃加熱回流3 h，減壓干燥并用二氯甲烷溶解，再加2 mol/L氫氧化鈉(NaOH)200 mL攪拌分層，收集下層液，減壓蒸干并用適量乙醚溶解，加適量的水充分搖勻，收集上層液，減壓干燥得樺木醇粗品3.452 g。取樺木醇粗品，硅膠柱層析后減壓干燥得樺木醇純品。樺木醇純品用適量丙酮溶解并快速攪拌冷卻至5～10℃后，逐滴加入新制的瓊斯試劑，使樺木醇與瓊斯試劑的摩爾比為1∶6，20℃反應3 h，過濾除去墨綠色沉淀，減壓蒸干丙酮，殘液用乙酸乙酯萃取，水洗，10%碳酸氫鈉(NaHCO3)洗滌，有機相用無水硫酸鎂(MgSO4)干燥，所得淡黃色固體即為樺木酮酸粗品。樺木酮酸粗品用乙醚溶解，快速柱色譜分離，減壓干燥，得樺木酮酸純品。取樺木酮酸純品用硼氫化鈉/四氫呋喃(NaBH4/THF)還原，將所得固體溶于20 mL甲醇并煮沸15～20 min，冷卻重結晶得BA。

1.2 試驗動物與飼糧

選用體重18～22 g、5～6周齡的雄性昆明(KM)小鼠為試驗動物。試驗飼糧為小鼠專用飼料，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，其主要營養水平如下:粗蛋白質(CP)20.50%、粗脂肪(EE)4.62%、鈣(Ca)1.23%、磷(P)0.91%、賴氨酸(Lys)1.30%、蛋氨酸+胱氨酸(Met+Cys)0.68%。

1.3 試驗設計

將28只KM小鼠于溫度為21～25℃、相對濕度為60%的飼養房中飼養1周后，隨機分為4組，每組7只。1組為對照組，每天每只通過灌胃給予1%可溶性淀粉溶液0.2 mL;2、3、4組為試驗組，每天每只通過灌胃給予含不同劑量BA的1%可溶性淀粉溶液(分別按每千克體重0.25、0.50、1.00 mg的劑量將BA混懸于1%可溶性淀粉溶液中)0.2 mL。通過預試驗確定試驗期為14 d。

1.4 樣品采集

試驗結束后，各組小鼠禁食(自由飲水)12 h，頸椎脫臼處死，解剖后取出脾臟和胸腺。將脾臟和胸腺用預冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分后稱重，按組織與預冷生理鹽水1∶10的質量體積比制成10%組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，收集上清液待測。

1.5 測定指標與方法

測定脾臟和胸腺中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，丙二醛(MDA)含量以及總抗氧化能力(T-AOC)。其中，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定;GSH-Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)法測定;MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定;T-AOC采用FRAP(化學比色法)法測定。采用考馬斯亮藍法測定脾臟和胸腺中總蛋白含量。總蛋白、MDA、SOD、GSH-Px與T-AOC測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.6 數據分析和處理

采用SPSS 16.0軟件進行數據處理，結果以平均值±標準差表示。采用t檢驗分析組間差異顯著性。

2 結果

2.1 BA對小鼠免疫器官中SOD活性的影響

由表1可知，各試驗組脾臟和胸腺中SOD活性較對照組均有所升高，并隨BA劑量的增加而升高，呈量效遞增關系。與對照組相比，4組脾臟中SOD活性顯著升高(P＜0.05)，同時胸腺中SOD活性極顯著升高(P＜0.01)。

2.2 BA對小鼠免疫器官中GSH-Px活性的影響

由表2可知，各試驗組脾臟和胸腺中GSH-Px活性較對照組均有所升高，但不呈量效遞增關系。與對照組相比，3和4組脾臟中GSH-Px活性均顯著升高(P＜0.05);3組胸腺中GSH-Px活性顯著升高(P＜0.05)。

2.3 BA對小鼠免疫器官中MDA含量的影響

由表3可知，各試驗組脾臟和胸腺中MDA含量較對照組均有所降低，并隨BA劑量的增加而降低，呈量效遞減關系。與對照組相比，3組脾臟中MDA含量顯著降低(P＜0.05)，4組脾臟中MDA含量極顯著降低(P＜0.01);2、3和4組胸腺中MDA含量均極顯著降低(P＜0.01)。

表1 BA對小鼠脾臟和胸腺中SOD活性的影響Table1 Effects of BA on SOD activity of spleen and thymus in mice(n=7) U/mg prot

表2 BA對小鼠脾臟和胸腺中GSH-Px活性的影響Table2 Effects of BA on GSH-Px activity of spleen and thymus in mice(n=7) U/mg prot

表3 BA對小鼠脾臟和胸腺中MDA含量的影響Table3 Effects of BA on MDA content of spleen and thymus in mice(n=7) nmol/mL

2.4 BA對小鼠免疫器官中T-AOC的影響

由表4可知，各試驗組脾臟和胸腺中T-AOC較對照組均有所升高，并隨BA劑量的增加而升高，呈量效遞增關系。與對照組相比，3組脾臟中T-AOC顯著升高(P＜0.05)，4組脾臟中T-AOC極顯著升高(P＜0.01)，3和4組胸腺中T-AOC均極顯著升高(P＜0.01)。

表4 BA對小鼠脾臟和胸腺中T-AOC的影響Table4 Effects of BA on T-AOC of spleen and thymus in mice(n=7) U/mg prot

3 討論

SOD和GSH-Px是機體內廣泛存在的、重要的催化過氧化氫(H2O2)分解的酶[8]。SOD是機體代謝的關鍵酶，可調節機體的氧化與抗氧化的平衡，其活性的高低反映了機體清除氧自由基能力的強弱，在機體抗氧化損傷、抗衰老與免疫調節過程中發揮著重要作用[8，12]。GSH-Px 是 H2O2防御系統成員，可以清除活細胞內過氧化物，在保護細胞免受自由基損傷的過程中起著關鍵作用[12]。據報道，BA能顯著降低由甲醇或鎘誘導的人中性白細胞中超氧陰離子數量[13]，刺激巨噬細胞吞噬能力增強，提高巨噬細胞中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平以及 SOD、GSH-Px 活性[8]，增強淋巴細胞活性和改變T、B淋巴細胞數目或亞群，增加綿羊紅細胞(SRBC)免疫小鼠溶血空斑數[9]，混合調控Th1/Th2類細胞因子[10]，說明BA具有細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫的功能。本試驗顯示，BA可提高小鼠脾臟和胸腺中SOD和GSH-Px活性，表明BA可通過增強SOD和GSHPx活性來保護小鼠免疫器官免受自由基的損傷，從而提高免疫器官的抗氧化能力。

MDA是不飽和脂肪酸過氧化產物之一，其產量的高低可反映過氧化程度的強弱。生物膜中的不飽和脂肪酸易被自由基攻擊而發生過氧化，導致結構和功能發生變化，這些變化勢必影響細胞基本的生命活動，最終導致淋巴細胞功能低下[12]。本試驗中，BA可降低小鼠胸腺和脾臟中MDA含量，表明BA可以通過調節脂質過氧化程度而影響小鼠免疫器官的抗氧化能力。

T-AOC代表體內酶類和非酶類抗氧化物質的總和，是反映機體抗氧化能力的重要指標，其強弱與健康狀況和疾病狀態之間存在著密切的聯系，當其降低時，會引起炎性反應、腫瘤和免疫系統疾病等[14]。本試驗發現，BA能提高小鼠脾臟和胸腺中T-AOC，并隨BA劑量的增加而升高，呈量效遞增關系。這說明BA可增加小鼠免疫器官中酶類或非酶類抗氧化物質的合成，進而增強免疫器官的抗氧化能力。

4 結論

BA可提高小鼠脾臟和胸腺中SOD、GSH-Px活性以及T-AOC，降低脾臟和胸腺中MDA含量，進而增強免疫器官的抗氧化能力。

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