低溫誘導(dǎo)甜菜(Beta vulgaris L.)Ty7Br600基因的Northern blotting和Southern blotting分析

戴建軍，程大友，常 纓，李彩鳳，閆桂萍，馬鳳鳴

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150001；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

甜菜（Beta vulgaris L.）是二年生作物，通常情況下第一年進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，第二年經(jīng)春化作用后塊根發(fā)芽、抽薹。但是，由于某些原因甜菜也會(huì)出現(xiàn)當(dāng)年抽薹的現(xiàn)象，稱(chēng)為早抽薹。早抽薹植株消耗大量光合產(chǎn)物用于生殖生長(zhǎng)，影響塊根增長(zhǎng)和糖分積累，致使塊根產(chǎn)量減產(chǎn)可達(dá)20%，含糖率甚至可降低1.6%，工藝品質(zhì)差，不耐貯藏，嚴(yán)重影響甜菜的生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為遺傳與環(huán)境因素都能影響甜菜抽薹。二年生甜菜抽薹需要低溫和長(zhǎng)日照才能表達(dá)[1-2]。對(duì)于一定的甜菜品種，早抽薹主要是低溫的累積作用繼之以長(zhǎng)日照或低溫與長(zhǎng)日照相伴的誘導(dǎo)結(jié)果[3-5]。二年生甜菜幼苗在0～10℃溫度下，連續(xù)光照，可以誘導(dǎo)其抽薹[6]。Barzen等首先用RFLP方法繪制了甜菜重要農(nóng)藝性狀的染色體連鎖圖譜，抽薹基因B位于xxpKP826標(biāo)記之間[7]；Schondelmaier等將以上連鎖標(biāo)記確定在II號(hào)染色體上[8]。El-Mezawy等用AFLP分子標(biāo)記方法篩選到17個(gè)距顯性等位基因位點(diǎn)B不到3.2 cM的標(biāo)記位點(diǎn)，其中有2個(gè)標(biāo)記距B基因只有0.14和0.23 cM，還有2個(gè)標(biāo)記為0.5 cM[9]。Abe等將甜菜抽薹前的生長(zhǎng)階段分為植物對(duì)低溫感應(yīng)階段（春化階段，要求低溫性的基因起作用）和環(huán)境因子感應(yīng)階段（后春化階段），感應(yīng)日照及溫度的基因起作用。通過(guò)傳統(tǒng)的雜交試驗(yàn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)影響抽薹性幾個(gè)主要基因，如一年生甜菜抽薹基因B、B'基因的等位基因易抽薹基因和晚抽薹基因lb[2,10]，但至今對(duì)甜菜抽薹基因片段序列及其特性的報(bào)道還很少。

本研究在利用代表性差異分析cDNA-RDA技術(shù)克隆了低溫誘導(dǎo)的甜菜幼苗差異表達(dá)基因片段和cDNA的末端快速擴(kuò)增（Rapid amplification of cDNA ends）的基礎(chǔ)上獲得的Ty7Br600基因片段序列，進(jìn)行Northern和Southern雜交分析。探討了二年生甜菜當(dāng)年抽薹的相關(guān)基因Ty7Br600的特性，為揭示二年生甜菜當(dāng)年抽薹的分子機(jī)理以及甜菜生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)與低溫誘導(dǎo)

二年生栽培甜菜甜研7號(hào)（Ty7），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)作物栽培系提供。

Ty7甜菜種子在室溫下浸種7 h，置于培養(yǎng)皿中25℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，萌發(fā)后置2～4℃低溫處理72 d，光照16 h，誘導(dǎo)抽薹。以25℃恒溫箱中萌發(fā)2～3 d的幼苗為對(duì)照。

1.2 RNA提取

將誘導(dǎo)抽薹前、后采集的甜菜莖尖樣品，按照Trizol試劑盒（GibcolBRL公司）操作程序提取莖尖RNA。具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。進(jìn)一步通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.3 Northern雜交分析

甜菜幼苗分別于低溫誘導(dǎo)前后進(jìn)行采樣，Trizol提取總RNA，分別取等量的總RNA進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖凝膠分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，烘干，42℃預(yù)雜交3 h。以Ty7的cDNA為模板，根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]克隆的Ty7Br600序列結(jié)果設(shè)計(jì)A49（5'CGAAAGCGGCATAGCAAAGGAA 3'）和B75（5'ACATAAGCGCAGCCAGTAACAT 3'）為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段后，用Promega公司的隨機(jī)引物標(biāo)記Kit Prime-a-Gene?Labeling System，以α-32P-dATP標(biāo)記，雜交及雜交后洗滌。將洗好的膜在空氣中稍晾干后，用保鮮膜包好，在暗室中定位于暗盒中，做好標(biāo)記，-70℃放射自顯影3～7 d。經(jīng)顯影、漂洗、定影獲得雜交結(jié)果，參照文獻(xiàn)[11]程序。

1.4 Southern雜交分析

用SDS法提取甜菜幼苗DNA，取約16 μg基因組DNA，用Eco RⅠ、HindⅢ進(jìn)行酶切，電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，烘干，預(yù)雜交。以克隆的全長(zhǎng)cDNA片段為探針，探針標(biāo)記、雜交及雜交后洗滌，放射自顯影，參照文獻(xiàn)[11]程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 Northern雜交分析

2.1.1 探針的制備

以Ty7的cDNA為模板，以A49和B75為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增回收的片段回收后，隨機(jī)引物標(biāo)記后作探針。瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 探針的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of the probe

2.1.2 Northern印記雜交

以PCR擴(kuò)增獲得差別表達(dá)基因片段，按隨機(jī)引物標(biāo)記法制成探針，并用來(lái)與未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)培養(yǎng)的甜菜幼苗RNA群體進(jìn)行Northern雜交。結(jié)果在低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)的甜菜幼苗的RNA群體中，出現(xiàn)較強(qiáng)的雜交條帶，而在未誘導(dǎo)培養(yǎng)的甜菜幼苗的RNA群體中，則沒(méi)有陽(yáng)性雜交條帶出現(xiàn)（見(jiàn)圖2）。Northern雜交試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，Ty7Br600這一序列有可能是二年生甜菜幼苗經(jīng)低溫誘導(dǎo)處理之后被誘導(dǎo)特異表達(dá)的與抽薹相關(guān)的新基因序列。

圖2 Northern印記雜交Fig.2 Northern blotting hybridization

2.2 Southern雜交分析

2.2.1 DNA的提取及純化

用SDS法提取甜菜葉片基因組DNA，進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 甜菜葉片基因組DNA的提取Fig.3 Isolation of genomic DNA of Beta vulgaris L.

由圖3可知，甜菜基因組DNA為10kb以上，提取純化后的DNA無(wú)降解，完全可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2.2 DNA的限制性?xún)?nèi)切酶酶切

分別用Eco RⅠ，Bam HⅠ和HindⅢ對(duì)Ty7 DNA進(jìn)行酶切，瓊脂糖電泳結(jié)果如圖4所示。

圖4 甜菜基因組DNA的限制性?xún)?nèi)切酶消化Fig.4 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of Beta vulgaris L.degested with restriction endonucleases

2.2.3 Ty7Br600基因在甜菜基因組中的分布

以500 bp的cDNA差異片段為探針，與基因組DNA進(jìn)行Southern雜交。由圖5可知，這些差異cDNA片段探針同經(jīng)酶切消化的基因組DNA進(jìn)行Southern雜交時(shí)，在每一組酶切中至少有2～3條條帶，且有1條帶的強(qiáng)度明顯高于其他條帶，表明這些cDNA差異片段確為甜菜基因組片段，也同時(shí)表明該基因在甜菜基因組中以2個(gè)拷貝或低拷貝形式存在。

圖5 Southern印記雜交Fig.5 Southern blotting hybridization

3 討論

甜菜當(dāng)年抽薹嚴(yán)重影響甜菜產(chǎn)量、工藝品質(zhì)和貯藏。但隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，揭示甜菜當(dāng)年抽薹機(jī)理，并提出調(diào)控技術(shù)已經(jīng)成為可能。本研究對(duì)已經(jīng)克隆到的低溫和長(zhǎng)日照誘導(dǎo)表達(dá)的基因[12-13]，進(jìn)行Northern和Southern雜交分析，探討了二年生甜菜當(dāng)年抽薹的相關(guān)基因特性，為揭示二年生甜菜當(dāng)年抽薹的分子機(jī)理以及甜菜生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

引起甜菜當(dāng)年抽薹的內(nèi)在因素是品種特性，即甜菜一年或二年生的習(xí)性；而外在因素是生態(tài)條件即低溫、長(zhǎng)日照等條件。一年生甜菜不需低溫也可以抽薹，但仍需一定的長(zhǎng)日照；而二年生甜菜當(dāng)年必須滿(mǎn)足其低溫和長(zhǎng)日照等條件，才會(huì)出現(xiàn)當(dāng)年抽薹的現(xiàn)象，抽薹基因B要通過(guò)外界因素（如后春化階段的長(zhǎng)日照，高溫）才能起作用。因此栽培甜菜當(dāng)年抽薹的機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，不僅涉及到抽薹基因，還受一些與其相互作用的感光性基因影響。國(guó)內(nèi)外陸續(xù)有很多報(bào)道。甜菜抽薹是一個(gè)高度復(fù)雜而復(fù)合的，在一定遺傳背景下的生理生化及形態(tài)發(fā)生過(guò)程。甜菜植株接受環(huán)境因子誘導(dǎo)后，經(jīng)一系列信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，啟動(dòng)抽薹決定過(guò)程中的控制基因。這些過(guò)程中許多特異性基因按一定的時(shí)間順序和空間特異性程序啟動(dòng)和關(guān)閉，各個(gè)基因既具有獨(dú)立功能，又相互影響、相互制約。

抽薹性狀本身是一種質(zhì)量性狀，通常由單基因控制[14]，但是甜菜的整個(gè)抽薹過(guò)程卻必需經(jīng)過(guò)春化過(guò)程和適當(dāng)?shù)墓庵芷谡T導(dǎo)，因此就甜菜抽薹整個(gè)過(guò)程而言，抽薹過(guò)程是一系列春化作用、光周期和抽薹相關(guān)基因的接受外界刺激信號(hào)順序表達(dá)的結(jié)果[2]。遺憾的是，至今對(duì)甜菜抽薹的本質(zhì)和機(jī)理還未研究清楚。要想弄清其本質(zhì)機(jī)理，就必需追根溯源，找到控制甜菜抽薹的主效基因和連鎖的相關(guān)基因，才能從更深的層次即分子水平上解釋甜菜抽薹機(jī)理。如果能克隆出控制甜菜抽薹的主效基因或幾個(gè)關(guān)鍵基因，則可以采用反義RNA控制二年生栽培甜菜抽薹基因的表達(dá)，用基因敲除等生物技術(shù)對(duì)基因組進(jìn)行重建改造，提高產(chǎn)糖量，應(yīng)用前景相當(dāng)廣闊。

4 結(jié)論

本文分別進(jìn)行Northern印跡和Southern印跡雜交。結(jié)果表明，Ty7Br600 cDNA差異片段只在低溫誘導(dǎo)的甜菜中表達(dá)，在甜菜基因組中以2個(gè)拷貝或低拷貝形式存在。本研究克隆到的低溫和長(zhǎng)日照誘導(dǎo)表達(dá)的基因，為研究甜菜抽薹及其調(diào)控的機(jī)理，最終采用生物技術(shù)手段控制甜菜抽薹、降低抽薹率和提高產(chǎn)糖量提供了理論基礎(chǔ)和基因材料。

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