卷丹與亞洲百合種間雜交花粉管生長的熒光觀察

雷家軍，吳 超

（沈陽農業大學園藝學院，沈陽 110866）

百合是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生草本觀賞花卉。雜交育種尤其是遠緣雜交育種是百合育種的重要手段，近年推出的百合新品種大部分是利用遠緣雜交技術育成的[1]。百合種間雜交中不親和性是一個普遍存在的問題。運用花粉管熒光觀察技術能夠直接判斷高等植物自交與異交過程中花粉管的生長情況，對研究花粉管生長特性及雜交不親和表達部位具有重要意義。熒光觀察法簡單方便快速有效，因此國內外學者普遍運用這種方法研究果樹、花卉等農作物雜交過程中花粉管生長情況[2-5]。本研究運用熒光顯微技術對三倍體卷丹百合與二倍體及四倍體亞洲百合品種種間雜交后花粉萌發和生長情況進行觀察，初步判斷其正反交的雜交親和性，為克服百合雜交受精前障礙及充分利用我國原產的適應性極強的特異三倍體卷丹百合資源奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自于沈陽農業大學花卉基地，應用野生百合卷丹（Lilium lancifolium Thunb.，2n＝3x＝36）與亞洲百合雜種系品種“多安娜”（Pollyanna，2n＝2x＝24）、“精粹”（Elite，2n＝2x＝24）和“布魯拉諾”（Brunello，2n＝4x＝48）進行正反交，共6個種間雜交組合：①卷丹×多安娜、②卷丹×精粹、③卷丹×布魯拉諾、④多安娜×卷丹、⑤精粹×卷丹、⑥布魯拉諾×卷丹。于授粉后不同時間取母本花柱及子房作為材料，對花粉管的生長情況進行熒光觀察。

1.2 方法

在母本開花前1 d去雄套袋，開花當天將新鮮的父本花粉涂抹于柱頭上，授粉時間為開花當天上午 7:00～10:00，于授粉后 4、8、24、48、72、96、120 h取花柱和子房放入干凈的青霉素小瓶中，每個組合取3～5個，用FAA固定液（70%酒精∶冰乙酸∶甲醛＝18∶1∶1）固定、保存。

觀察前將固定液倒掉，用蒸餾水沖洗花柱和子房，加入2 mol·L-1NaOH溶液，放在60℃溫箱中軟化2 h，倒掉堿液，用蒸餾水沖洗3次，加入用0.1 mol·L-1K2HPO4配制的0.1%苯胺藍溶液，染色2 h以上。觀察時將花柱連同子房取出，用解剖針將花柱和子房縱向剖開平鋪于載玻片上壓片，用Olympus熒光顯微鏡觀察花粉粒在柱頭上萌發、花粉管生長及伸向胚珠的情況，測量授粉后不同時間花粉管長度，并拍照。

2 結果與分析

2.1 卷丹作母本種間雜交授粉后花粉管熒光觀察

對卷丹與亞洲百合3個品種雜交授粉后花粉管生長的熒光觀察，發現這3個品種的花粉均可以在卷丹的柱頭上萌發。授粉后4 h，3個組合中多數花粉粒均已萌發并且花粉管長出一定長度，部分花粉管已伸出柱頭乳突組織。其中，卷丹×多安娜和卷丹×布魯拉諾兩個組合的柱頭附著及萌發的花粉較多，在熒光顯微鏡下可以觀察到明亮的黃綠色（見圖版Ⅰ-A）；卷丹×精粹組合的柱頭附著及萌發的花粉相對較少。

授粉后8～24 h，隨著時間的延長，柱頭上萌發的花粉數量增多，花粉管進入快速生長期，大量花粉管成束狀向花柱道中延伸（見圖版Ⅰ-B）。其中布魯拉諾的花粉管生長最快、到達花柱的2/3處（3.62 cm），多安娜次之、花粉管到達花柱1/2處（2.73 cm），精粹最慢、只延伸到達花柱的0.20 cm處。

授粉48 h后，多安娜、布魯拉諾的花粉管已進入子房，花柱道內精粹的花粉管較少，并且有明顯的回折現象；72 h后，布魯拉諾的花粉管到達子房2/3處（見圖版Ⅰ-C）并到達胚珠，精粹的花粉管也進入子房。本試驗中，卷丹×多安娜與卷丹×布魯拉諾組合授粉都能得到一定數量的有胚種子，而卷丹×精粹沒能得到有胚種子，這與以上熒光觀察的結果一致。

2.2 卷丹作父本種間雜交授粉后花粉管熒光觀察

2.2.1 多安娜×卷丹授粉后花粉管在花柱中的生長情況

授粉后4 h，花粉粒萌發很少；8 h花粉管仍纏結在柱頭表面；24 h花粉管進入花柱道內但花粉管中出現胼胝質；24～72 h花粉管向下伸長，到達花柱1/3處（1.76 cm），但花柱道內的花粉管較少，越向下花粉管越少，同時出現很多橫向生長、末端膨大異常現象，花粉管中多處出現胼胝質；授粉后96～120 h，僅有極少幾條花粉管到達花柱基部，胚囊細胞出現胼胝質。兩個月后田間雜交結實調查表明，這個雜交組合沒有得到有胚種子。

2.2.2 精粹×卷丹授粉后花粉管在花柱中的生長情況

授粉8～24 h才有少量花粉萌發；48～72 h花粉管回折異常現象明顯（見圖版Ⅰ-D），同時花柱道細胞有胼胝質出現（見圖版Ⅰ-E）；96～120 h，多數花粉管到達花柱1/5～1/4處（0.95～1.19 cm），僅極少量花粉管（0～3條）可伸長至花柱基部，到達子房，但沒有觀察到花粉管到達胚珠。兩個月后田間雜交結實調查表明，這個雜交組合也沒有得到有胚種子。

2.2.3 布魯拉諾×卷丹授粉后花粉管在花柱中的生長情況

授粉4～8 h后花粉粒萌發，表現正常；授粉后24 h，花粉管在柱頭表面出現明顯橫向生長異常現象；24～72 h花粉管在花柱道內回折、纏繞（見圖版Ⅰ-F）；72～120 h大多花粉管到達花柱1/2處（2.56 cm），少量花粉管進入子房到達胚珠。2個月后得到少量膨大蒴果和有胚種子。

圖版Ⅰ 卷丹與亞洲百合種間雜交授粉后花粉管生長熒光觀察PlateⅠ Fluorescence observation of pollen tube growth from interspecific hybridization between Lilium lancifolium Thunb.and Asiatic lilies

3 討論與結論

3.1 卷丹與亞洲百合種間雜交親和性

三倍體卷丹與亞洲百合二倍體和四倍體品種的正反交試驗中，卷丹作母本時雜交親和性較高，在卷丹×多安娜與卷丹×布魯拉諾兩個組合中得到了膨大的果實和有胚種子，表明卷丹是很好的母本材料。卷丹作父本時，花粉在授粉后4～24 h內雖能萌發形成花粉管，但在48～96 h觀察到很多異常橫向生長的花粉管，120 h時發現極少有花粉管穿過整個花柱到達子房，雜交親和性差，未能得到有胚種子。因此，在以卷丹為父本的雜交組合中，應加強對授粉方法的研究，可以試驗重復授粉、應用植物生長調節劑等方法促進子房膨大[6-9]，以期得到有胚種子。

3.2 種間雜交的花粉管異常現象

通過觀察花粉管的生長狀態有助于判斷雜交是否親和。有研究表明，多種植物雜交時花粉管生長均出現異常行為，主要表現在：花粉不能在異種柱頭上萌發；花粉雖能萌發，但存在著延遲阻礙，花粉管扭曲盤繞，不能或只有少量進人柱頭；花粉管進人柱頭后由于花粉管先端或全部沉積胼胝質而停止生長或纏繞、分叉、先端膨大、變小等異常現象導致生長緩慢甚至破裂；花粉管雖正常生長，但由于長度不夠而不能達到子房完成受精；花粉管即使達到子房，雌雄配子不能受精形成合子或只有卵核或極核發生單受精[10-15]。本試驗對不同百合種間雜交組合花粉管在花柱內生長情況的熒光顯微觀察發現，花粉基本都能萌發，萌發后花粉管穿過柱頭，進入花柱，但不同雜交組合的花粉萌發量和花粉管伸長存在差異，并且存在生長異常的花粉管，主要有4種異常現象：一是花粉管在末端出現膨大；二是花粉管橫向生長普遍；三是花粉管出現回折、纏繞；四是花粉管生長過程中出現大量胼胝質，出現的部位有花粉管、花柱道細胞、胚囊。王文和等觀察百合遠緣雜交時認為，“Bernini”柱頭乳突細胞是阻礙“Pollyanna”花粉管生長的第一道屏障，花柱道細胞是抑制花粉管在花柱內生長的第二道屏障[16]；李守麗等觀察到大百合與百合屬間雜交后花粉萌發與花粉管的伸長速度相對于自交滯后，個別花粉管出現末端分叉、膨大、變細或中間部分折疊，花粉管內胼胝質不規則大量沉積等現象[17]。雖然雜交親和性與花粉管的行為有關，但雜交的成功與否還受到受精后諸多因素的影響，還需要從胚胎學和遺傳學方面進一步探討。

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