冷水脅迫下水稻分蘗期耐冷性狀QTL定位研究

鄒德堂，李 姣，鄭洪亮，劉化龍，王敬國

（東北農業大學水稻研究所，哈爾濱 150030）

水稻對低溫反應較敏感，低溫引起水稻減產在世界高緯度和高海拔地區普遍發生，在中國東北和西南高海拔地區尤為突出。水稻在萌芽期、芽期、幼苗期、分蘗期、孕穗期、開花期和成熟期等生長發育時期都會發生不同程度的低溫冷害。在水稻生長早期，秈稻18℃以下、粳稻15℃以下，其生長就會受到不同程度的抑制。如幼苗期和分蘗期常遇到低溫脅迫，影響水稻早期的生長發育[1-2]。因此，水稻生長早期的耐冷性應引起研究人員的重視。分蘗期是水稻生長發育的一個重要時期，近年來，對水稻生長早期耐冷性研究多局限于萌芽期、芽期、幼苗前期，且大部分研究都處于探索階段。以粳粳雜交研究分蘗期耐冷性QTL定位報道還較少。因此需要從東北地區已有的粳稻群體中盡可能多地鑒定出有利的等位基因，對其進行表型效應的遺傳估算，對低溫處理條件下材料的敏感性進行評價，最終將克隆出的耐冷性有利基因聚合在一起，成功培育出東北地區耐冷優良品種。本試驗采用微衛星標記手段，對水稻生長早期耐冷性進行QTL定位研究，旨在找出影響水稻生長早期耐冷性狀的基因位點，為今后水稻生長早期耐冷基因的精細定位和分子標記輔助育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 作圖群體構建

本試驗以黑龍江地區高產優質水稻品種東農422和耐冷性強的水稻品種空育131作為雜交親本，雙親雜交所衍生的F2:3群體共180個株系作為研究對象。東農422由東北農業大學培育并提供，空育131原產于日本，由黑龍江省農墾科學院水稻研究所從吉林省農科院引進并選育而成。

1.2 水稻分蘗期耐冷性鑒定

2011年在東北農業大學香坊實驗實習基地進行。隨機區組設計，單行區，每行種植20株。常規栽培管理同一般田間生產。從插秧后25 d開始，用17℃冷水處理至成熟期，水深保持5 cm。在分蘗期調查苗高、分蘗數和葉綠素含量，并計算地上部生長量和冷水反應指數。冷水反應指數（CRI，%）＝（冷水處理區性狀表型值/自然區性狀表型值）×100%[3]。與處理組相應的對照組不灌溉冷水，采用大田常規栽培管理。

1.3 DNA提取和SSR檢測

分蘗盛期在每一家系內隨機選取5株新鮮葉片，放置于-80℃超低溫冰箱中保存。以CTAB法提取家系及親本總DNA[4]，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳40 min，通過凝膠成像儀觀察并統計DNA濃度，ddH2O進行DNA稀釋。PCR反應總體積為10 μL，體系包括3 μL的模板DNA（25 ng·μL-1），1 μL 10×PCR緩沖液，0.75 μL MgCl2（25 mmol·L-1），1 μL SSR引 物（12 ng·μL-1），0.15 μLdNTP（10 mmol·L-1），0.1 μL Taq酶（5U·μL-1），ddH2O補足至10 μL，最后加入液體石蠟覆蓋體系。PCR擴增步驟包括94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環，72℃延伸1 min，4℃保存。擴增結果采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法檢測。

1.4 遺傳連鎖圖譜的繪制和QTL分析

優先選用相關文獻中多態性好的引物以及Gramene網站中公布的引物數據，選擇均勻分布于水稻12條染色體上的600對SSR標記，由上海生工生物工程有限公司進行序列合成。經過兩個親本東農422和空育131的多態性檢驗，從中篩選出與兩個親本間有差異的引物，并利用篩選出有多態性的引物對F2代180個群體的DNA進行PCR擴增，并對擴增產物進行統計。應用軟件QTL IciMapping 3.1構建分子標記連鎖圖譜，利用Kosambi函數將重組率轉化為遺傳圖距（cM），利用Mapchart 2.1進行遺傳連鎖圖譜的繪制。

利用QTL IciMapping 3.1的完備區間作圖法（ICIM）進行QTL定位，取LOD＝2.5為QTL的閾值。QTL的命名原則遵循McCouch等提出的方法[5]。按照Stuber等方法[6]，根據顯性度（Dominant degree，DR）即顯性效應與加性效應的絕對值比值判斷每個QTL的基因作用方式。當DR≤0.2時，基因效應為加性；當0.2＜DR≤0.8時，基因效應為部分顯性；當0.8＜DR≤1.2時，基因效應為顯性；當DR＞1.2時，基因效應為超顯性。加性效應為正值表示增效等位基因來源于高值親本，為負值表示來源于低值親本。

2 結果與分析

2.1 作圖群體分蘗期耐冷性鑒定

在冷水脅迫和自然灌溉條件下，親本及F3家系群的苗高、分蘗數、地上部生長量、葉綠素含量及它們的冷水反應指數的變異范圍、變異系數和平均值列于表1。從冷水反應指數來看，分蘗期經過人工冷水脅迫后，東農422相關指標的冷水反應指數均低于空育131的各冷水反應指數，說明東農422的耐冷性比空育131弱。F3家系在苗高、分蘗數、地上部生長量和葉綠素含量等性狀經冷水處理后相應的平均值明顯低于自然灌溉條件，冷水處理對水稻分蘗期生長影響較大。從變異系數來看，冷水處理條件下各性狀的變異系數均高于自然條件下相應性狀的變異系數，說明F3株系的各性狀對冷水的反應存在較大差異。從變異范圍來看，冷水脅迫后的相應指標與自然對照相比明顯較低，說明分蘗期冷水脅迫使水稻生長受到抑制，各性狀表型值間均有不同程度下降。

表1 冷水處理條件和自然條件下親本及F3家系相關性狀的表型分析Table1 Phenotypic analysis of related traits with F3lines and parents at tillering stage under cold water irrigation and natural condition

從表1中可以看出，在冷水脅迫條件下，分蘗期F3家系在苗高、分蘗數、地上部生長量、葉綠素含量及其相應的冷水反應指數的平均值都介于親本之間。通過對數據處理發現，這些性狀的偏度、峰度絕對值均小于1，說明這些相關性狀符合正態分布。推斷上述性狀是由主基因和多基因共同控制的數量性狀，適合進行QTL定位。

2.2 水稻分蘗期耐冷相關性狀的QTL定位

以75個SSR標記構建水稻遺傳連鎖圖，利用QTL IciMapping 3.1軟件在分蘗期冷水處理條件下對水稻苗高、分蘗數、地上部生長量和葉綠素含量及其冷水反應指數進行QTL分析（列于表2）。共檢測到與分蘗期耐冷相關性狀相關的QTL 21個（見圖 1）。分布在第 2、3、5、6、7、8 和 12 染色體上，LOD值在2.50～6.69之間，貢獻率變幅為2.6%～52.2%。基因作用方式表現為加性、顯性、部分顯性或超顯性。其增效等位基因除大部分來自冷敏親本東農422，其余QTL均來源于耐冷親本空育131。

2.2.1 苗高

冷水處理條件下檢測到與苗高相關的QTL有3個，分別位于第7、8和12染色體上。其LOD值變異范圍為2.50～3.86，貢獻率變異范圍為6.9%～11.2%。其中位于第12染色體RM1302-RM415區間qSH-12對表型變異解釋率較大，為11.2%，是主效QTL。除qSH-12增效等位基因來自東農422，其余QTL的增效等位基因來自于空育131。這些QTL增效等位基因主要表現為加性。冷水灌溉條件下檢測到與苗高冷水反應指數的QTL有1個，位于第3染色體上。其LOD值為2.55，對表型變異解釋率為2.6%，其解釋率較小。qSHCRI-3的增效等位基因來自于東農422，基因作用方式表現為加性。

2.2.2 分蘗數

冷水條件下檢測到與分蘗數相關的QTL有3個，均位于第3染色體上。其LOD值范圍為2.98～3.99，位于第3染色體的RM251-RM1284區間的qNT-3-1對表型變異解釋率為52.2%，位于RM251-RM1284區間的qNT-3-2對表型變異解釋率為46.6%，很明顯這兩個QTL是主效QTL，且置信區間距離為28.17 cM（見圖1）。它們的增效等位基因均來自于空育131，基因作用方式表現為加性。

表2 分蘗期耐冷相關性狀QTL分析Table2 QTL analysis of related traits at tillering stage under cold water condition

冷水條件下檢測到與分蘗數冷水反應指數相關的QTL有4個，分別位于第2、3染色體上。其LOD值范圍為2.78～6.42，位于第3染色體的RM251-RM1284區間的qNTCRI-3-1、qNTCRI-3-2和qNTCRI-3-3對表型變異解釋率分別為45.6%、46.0%和43.6%，置信區間為28.17 cM，為主效QTL。而位于第2染色體的RM550-RM341區間的qNTCRI-2對表型變異解釋率為9.0%，貢獻率比較小。這4個QTL的增效等位基因均來自東農422，基因作用方式為加性。

2.2.3 地上部生長量

冷水條件下檢測到與地上部生長量相關的QTL有2個，分別位于第3和6染色體上。其LOD值分別為3.87和2.74，其中位于第3染色體RM251-RM1284區間的qAGB-3和位于第6染色體的RM1340-RM1370區間的qAGB-6對表型變異解釋率分別為50.8%和25.0%，是兩個主效QTL，其中qAGB-6的置信區間在50.0 cM以上（見圖1），還要進行精確的定位以找到準確的QTL位點。這2個QTL增效等位基因都來源于空育131，基因作用方式表現為加性。

冷水條件下檢測到與地上部生長量冷水反應指數相關的QTL有2個，分別位于第3、6染色體上。其LOD值分別為3.10和2.58，其中位于第3染色體RM251-RM1284區間qAGBCRI-3的表型變異解釋率為43.7%，是主效QTL，置信區間為28.17 cM，還有待于進一步驗證（見圖1）。而位于第6染色體的RM340-RM494區間qAGBCRI-6的表型變異解釋率為4.0%，它的貢獻率較小。qAGBCRI-3增效等位基因來自東農422，qAGBCRI-6增效等位基因來自空育131。基因作用方式表現為加性。

圖1 冷水脅迫下水稻分蘗期相關性狀及其冷水反應指數的QTL區間分布Fig.1 QTL interval mapping of related traits and their cold response index at tillering stage under cold water stress in rice

2.2.4 葉綠素含量

冷水條件下共檢測到與葉綠素含量相關的QTL有4個，分別位于第2、5、7和12染色體上。其LOD值變異范圍為2.70～6.69，對表型變異解釋率為6.1%～17.1%。其中位于第7染色體RM1306-RM1357區間qCC-7對表型變異解釋率為17.1%，是主效QTL，置信區間為10.2 cM。是一個比較準確的QTL位點，可能在這個區間內存在一個有關耐冷條件下葉綠素含量的QTL位點，有待于在這方面尋找理論依據找出這個QTL位點。其他3個QTL對表型變異解釋率均較小。

qCC-12增效等位基因來自空育131，其余3個QTL的增效等位基因均來自東農422。qCC-5和qCC-7增效等位基因表現為加性，qCC-2增效等位基因表現為部分顯性，qCC-12增效等位基因表現為超顯性。

冷水條件下檢測到與葉綠素含量冷水反應指數相關的QTL有2個，位于第2、8染色體上。其LOD值分別為4.36和2.67，其中位于第2染色體RM207-RM208區間qCCCRI-2的解釋率較大，為15.4%是主效QTL。而qCCCRI-8的貢獻率比較小。qCCCRI-2和qCCCRI-8的增效等位基因都來自東農422。qCCCRI-2基因作用方式表現為顯性，qCCCRI-8基因作用方式表現為加性。

3 討 論

3.1 水稻分蘗期耐冷性分析

研究表明水稻耐冷性是一個復雜的遺傳性狀。水稻分蘗是決定產量的一個重要農藝性狀，適當的分蘗數目直接決定水稻產量。水稻分蘗不僅是直接調控產量的一個關鍵農藝性狀，同時也是在植物生物學中決定株型建成的一個核心問題。分蘗期是水稻對低溫冷害影響較為敏感的一個時期。因此，研究分蘗期水稻相關性狀耐冷性有著重要意義。前人對分蘗期耐冷性報道較少，大多集中在低溫下幼苗生長活力、低溫下發芽率等幼苗前期的報道。Jun等研究指出，低溫發芽力主要由基因累加效應所控制，在F2代呈連續分布，其平均值偏向于低溫發芽力較高的親本，幼苗期耐冷性表現為以雙親中間值為中心或稍傾向于耐冷性強親本的連續分布[7]。Li和Rutger指出，F1和F2代水稻幼苗長勢在低溫下呈顯性和超顯性[8]。本研究采用東農422/空育131群體組合，分蘗期經冷水灌溉之后，在苗高、分蘗數、地上部生長量和葉綠素含量方面東農422的冷水反應指數比空育131的冷水反應指數低，空育131的耐冷性要強于東農422。分蘗期冷水灌溉處理后性狀與對照差異明顯。F3家系經過分蘗期冷水脅迫后，冷水處理的變異范圍要低于自然對照部分變異范圍，而冷水脅迫后的變異系數明顯高于對照組，其平均值偏向于耐冷性較強的親本。

3.2 水稻分蘗期耐冷相關性狀QTL定位

當前分子標記技術的發展為闡明QTL性狀遺傳基礎提供強有力證據。迄今為止，對于水稻分蘗期耐冷相關性狀QTL定位報道還較少。韓龍植等以葉赤枯度作為分蘗期耐冷性研究指標，利用秈粳交F2∶3代將有關葉赤枯度基因位點定位到第2、3、7、9、11染色體，貢獻率在6.5%～7.9%范圍內[9]。苗高是有關水稻生長發育的一個重要指標，有關水稻苗高、分蘗數QTL的研究已取得一定進展，前人研究過苗高分子標記的遺傳分析，檢測到12條染色體上的9條染色體有相關的QTL位點[10]。本試驗中苗高QTL定位到第7、8、12染色體上，與前人定位結果大體相同。有研究學者認為水稻分蘗是一個復雜的發育性狀，易受環境影響，對水稻產量形成影響較大，分蘗數目通常被認為是受數量性狀位點控制。Wu等利用RFLP標記定位控制水稻數量性狀的QTL時發現兩個控制分蘗數目的QTLs分別位于第4和第12染色體上[11]。任翔等利用RIL群體對水稻分蘗能力進行QTL定位分析，在第2、5、8、9染色體上發現4個QTLs位點對分蘗能力有貢獻，在第1、2染色體上成簇分布[12]。本研究通過微衛星標記進行分蘗數目基因定位，只在第3染色體上檢測到影響分蘗數目QTLs，貢獻率較小，很可能是由于微效基因控制的數量性狀，也可能是不同材料控制各時期耐冷性的基因有差異，導致群體耐冷性遺傳和生理特性產生差異，或不同處理條件導致基因調控網絡有細微差異，使耐冷基因作用發生變化。

有關水稻葉綠素含量QTL定位的報道較少。崔克輝等利用RIL群體定位到2個控制劍葉葉綠素含量的QTL，貢獻率僅為4.66%～6.67%[13]。汪斌等在第1、4、11染色體上檢測到6個控制葉綠素a和b的QTL，貢獻率為0.17%～10.71%[14]。在Ishimaru等構建的含有主要農藝性狀和生理性狀QTL的功能圖譜中，有6個影響葉綠素含量的QTLs，分布于第1、3、5、8、12染色體上，貢獻率為7.80%～10.80%[15]。通過以上數據比較可以發現，控制葉綠素含量的QTL貢獻率大多在10%以下，說明葉綠素含量可能是由微效QTL控制。本研究中有關葉綠素含量QTL定位研究表明，在第2、5、7、12染色體上檢測到影響分蘗期葉綠素含量的QTL位點，與前人研究結果不完全一致。其中位于第7染色體上的QTL置信區間較小（10.2 cM），對表型變異解釋率（17.7%）較大，有可能是一個控制葉綠素含量的主效基因位點，為分蘗期葉綠素含量精細定位提供理論依據。

在前人研究中有關地上部生長量以及各性狀CRI值QTL定位的報道尚少見。地上部生長量是通過苗高和分蘗共同作用體現出來的，是分蘗期水稻生長的一個重要指標，是分蘗期生長情況的綜合體現。研究地上部生長量QTL定位有助于找到由苗高和分蘗合同協作的位點，為寒地粳稻研究開辟更加廣闊的領域。本研究中影響地上部生長量QTL定位在第3、6染色體上，貢獻率在25.05%以上，置信區間在28.17 cM，是主效QTL。在以后的研究中可以在這個染色體目標區段上進行精細定位研究，試圖找到與地上部生長量相關的QTL位點，為今后寒地粳稻分蘗期耐冷性研究提供參考依據。冷水反應指數是低溫處理下性狀表型值與自然條件下性狀表型值的相對比值，可以客觀的評價性狀在低溫下受害程度。有關冷水反應指數研究報道較少，對于CRI定位還處于初步階段。本研究中，分蘗數CRI值QTL定位和葉綠素含量CRI值的QTL貢獻率較大，而苗高CRI值QTL和地上部生長量CRI值QTL貢獻率較小。其基因作用方式表現為加性效應或顯性效應。說明水稻耐冷相關性狀CRI在雜交后代早期不易穩定，而在高世代才能穩定，故對其進行選擇要在世代相對較穩定時進行。本試驗研究冷水反應指數QTL定位，揭示脅迫處理與對照處理相互之間的關系，明確寒地粳稻耐冷性遺傳基礎，為今后寒地稻作冷害研究提供理論依據。

4 結論

本研究在冷水脅迫條件下，水稻分蘗期的苗高、分蘗數、地上部生長量和葉綠素含量及其冷水反應指數表現為近似正態的連續分布，認為是由主效基因和微效基因共同控制的數量性狀。在第2、3、6、7、12染色體上有11個貢獻率較大的QTL位點。其中，冷水脅迫下與苗高相關的QTL 3個；與苗高冷水反應指數相關的QTL 1個；與分蘗數相關的QTL 3個；與分蘗數冷水反應指數相關QTL 4個；與地上部生長量相關的QTL 2個；與地上部生長量冷水反應指數相關的QTL 2個；與葉綠素含量相關的QTL 4個；與葉綠素冷水反應指數相關的 QTL 2 個。其中 qSH-12、qNT-3-1、qNT-3-2、qNTCRI-3-1、qNTCRI-3-2、qNTCRI-3-3、qAGB-3、qAGB-6、qAGBCRI-3、qCC-7和qCCCRI-2對表型變異的解釋率較大，分別為11.2%、52.2%、46.6%、45.6%、46.0%、43.6%、50.8%、25.0%、43.7%、17.7%和15.4%，為主效QTL。

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