篤斯越橘再生體系的建立

代志國，遲夜朦，梁曉晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

篤斯越橘（Vaccinium ulignosum L.）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium ssp.）植物，落葉小灌木，果實(shí)為藍(lán)紫色小漿果，又名藍(lán)莓，果實(shí)中含有較多的花色素苷、黃酮等生理活性成分，有緩解視疲勞、防治高血壓、抗癌等功效。篤斯越橘由于生于林間腹地，無污染，是綠色純天然食品，極具開發(fā)利用價值。我國篤斯越橘主要分布在大、小興安嶺及長白山等地區(qū)，是東北地區(qū)寶貴的森林資源和重要的山特產(chǎn)品之一。近幾年，隨著我國篤斯越橘果實(shí)的大量出口和國內(nèi)越橘系列產(chǎn)品的開發(fā)，目前鮮果市場價格逐年上升，果實(shí)供不應(yīng)求。篤斯越橘因其常規(guī)繁殖難度很大，開發(fā)和利用受到限制。目前利用植物組培技術(shù)進(jìn)行快繁體系研究較少。為更好地開發(fā)利用這一極具經(jīng)濟(jì)價值的珍貴野生資源，試驗(yàn)研究利用植物組培技術(shù)建立高效、遺傳穩(wěn)定的快繁體系，為篤斯越橘快速繁殖、種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳轉(zhuǎn)化與創(chuàng)新等提供理論依據(jù)和技術(shù)支持[1-2]。

1 材料與方法

1.1 材料

篤斯越橘來源于黑龍江省伊春地區(qū)，是由伊春市農(nóng)業(yè)推廣中心經(jīng)多年選育的篤斯越橘優(yōu)系，在每年4月份篤斯越橘休眠期，采集一年生枝條帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 外植體的處理

將一年生篤斯越橘枝條在室溫條件下，采用室內(nèi)水培法促使腋芽萌發(fā)，然后將萌動的枝條在10℃條件下預(yù)處理7 d。將經(jīng)過室內(nèi)水培及10℃條件下處理的枝條，剪取1 cm莖段及長勢飽滿的單芽為外植體，在流水狀態(tài)下沖洗1 h后，采用兩種方法處理：①外植體為帶芽的莖段時，采用75%酒精浸泡1 min，無菌水沖洗3次，0.1%升汞浸泡10 min，無菌水沖洗6次，并用無菌濾紙吸去表面水分備用；②以單芽為外植體時，采用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次，0.1%升汞浸泡8 min，無菌水沖洗6次，并用無菌濾紙吸去表面水分備用。

1.2.2 培養(yǎng)條件

以改良WPM為基本培養(yǎng)基。制備時，將原WPM 培養(yǎng)基中的 K2SO4、CaCl2、FeSO4和Na2EDTA以 Ca（NO3）2·4H2O 684 mg·L-1、KNO3190 mg·L-1、C10H13FeN2NaO873.4 mg·L-1和鹽酸硫胺素0.1 mg·L-1代替。添加蔗糖20mg·L-1、瓊脂6～8g·L-1用1mol的NaOH調(diào)節(jié)pH 4.8左右；培養(yǎng)基在121℃、131 kPa條件下滅菌15～20 min。在溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2 500 lx，光周期為16 h黑暗、8 h光照的條件下培養(yǎng)。

1.2.3 不同激素對莖段及單芽生長的影響

試驗(yàn)采用兩種激素處理：以改良WPM為基本培養(yǎng)基，ZT設(shè)三種濃度，分別為1.0、1.5、2.0 mg·L-1；NAA設(shè)三種濃度，分別為0.2、0.3、0.4 mg·L-1。培養(yǎng)4周后，觀察芽的生長狀況，統(tǒng)計成活率。

1.2.4 不同外植體類型對增殖效果的影響

以莖段和單芽為外植體培養(yǎng)的無菌苗長到2 cm以上時，進(jìn)行轉(zhuǎn)接，繼代增殖。將綠色幼苗的莖剪切成單芽或1 cm長的帶芽小段，接種到添加ZT 1.5 mg·L-1的改良WPM培養(yǎng)基上。培養(yǎng)4周后，觀察生長狀況，統(tǒng)計增殖系數(shù)。

1.2.5 適宜生根培養(yǎng)基的篩選

將增殖培養(yǎng)獲得的健壯幼苗從莖基部切下，接種到生根培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基采用改良1/2WPM為基本培養(yǎng)，IBA設(shè)三種濃度，分別為0.05、0.1、0.15 mg·L-1；IAA設(shè)三種濃度，分別為0.1、0.3、1.5 mg·L-1。培養(yǎng)4周后，觀察生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素處理對篤斯越橘莖段萌芽及單芽誘導(dǎo)的影響

篤斯越橘莖段的萌芽及單芽增殖率受到培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的調(diào)控，在添加ZT及NAA的培養(yǎng)基上，外植體接種7 d左右開始生長，首先在外植體節(jié)處萌生綠色嫩芽，基部產(chǎn)生黃綠色愈傷組織塊，但是莖段基部形成的愈傷組織最終不會產(chǎn)生幼芽，20 d后為腋芽開始迅速生長，葉片為新綠色，無黃化葉和枯死葉，1個節(jié)可萌生1～4個芽，芽體長至1 cm后，在其葉腋萌發(fā)新芽形成較多分枝。由表1和表2可知，對于莖段和單芽而言，ZT濃度為1.5 mg·L-1時，萌芽數(shù)多，且增殖倍數(shù)最高；NAA為0.3 mg·L-1萌芽數(shù)最多，隨著NAA濃度增加，增殖率也增加，但在生長過程中幼苗易玻璃化，效果并不理想。

表1 不同激素種類及濃度對篤斯越橘莖段萌芽誘導(dǎo)的影響Table1 Influence of different hormones on stem segments induce buds of Vaccinium ulignosum

表2 不同激素種類及濃度對篤斯越橘單芽誘導(dǎo)的影響Table2 Influence of different hormones on single induce buds of Vaccinium ulignosum

2.2 不同外植體類型對篤斯越橘繼代增殖效果的影響

以莖段和單芽經(jīng)初代培養(yǎng)誘導(dǎo)的叢生芽為外植體，進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，采用的培養(yǎng)基為WPM+1.5 mg·L-1ZT+1.5 mg·L-16-BA+15 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂。由表3可以看出，莖段誘導(dǎo)的叢生芽轉(zhuǎn)接3 d后腋芽開始膨大，1個節(jié)萌發(fā)1～4個芽，萌芽數(shù)與營養(yǎng)生長的外植體相比要少，2周后新芽長達(dá)2 cm以上，新芽葉腋再萌芽形成分枝，增殖倍數(shù)達(dá)到8.6倍。單芽經(jīng)初代培養(yǎng)誘導(dǎo)的叢生芽接種1周后可伸長生長至1.5 cm，基部產(chǎn)生少量的愈傷組織，2周后可達(dá)到5 cm以上，繼代增殖率可達(dá)9.4倍。因此，經(jīng)營養(yǎng)生長培養(yǎng)出的莖段和單芽的叢生芽苗都可用于繼代增殖。

表3 不同外植體類型對篤斯越橘繼代增殖效果的影響Table3 Influence of different types of explants on Vaccinium ulignosum L.proliferation

2.3 生長素組合對篤斯越橘生根的影響

以改良的1/2WPM為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的IAA和IBM組合，比較不同濃度的配比對篤斯越橘生根的影響（見表4）。

由表4可以看出，處理6的效果最好，差異顯著，根系發(fā)達(dá)，葉色濃綠，其生根成活率最高，為82.3%；生根效果最差的是處理1，生根成活率為29.7%，它與處理7差異不顯著，其特點(diǎn)是IAA的濃度偏低。通過比較發(fā)現(xiàn)，IAA濃度為1.5 mg·L-1，IBA濃度為0.1 mg·L-1的組合最好，其最佳培養(yǎng)基為：1/2WPM+1.5 mg·L-1IAA+0.1 mg·L-1IBA。

表4 不同生長素組合對生根的影響Table4 Influence of different hormones combination on rooting

3 討論

本試驗(yàn)采用的外植體均采用室內(nèi)水培及10℃預(yù)處理，使外植體處于旺盛的生長狀態(tài)，減少褐變的發(fā)生，增大芽體存活率，與Wolfe等研究結(jié)果相符合[3]。本試驗(yàn)采用的改良WPM基本培養(yǎng)基與馬艷麗以改良WPM為基本培養(yǎng)基培養(yǎng)矮叢越橘相比效果更好[4]。

有效控制污染是植物組培成功的關(guān)鍵技術(shù)之一。本試驗(yàn)中從不同外植體類型篩選結(jié)果中的污染率來看，兩種外植體都有污染現(xiàn)象的發(fā)生，其中以單芽的污染率最小，且啟動率最高；帶芽莖段污染率較高，其原因是越橘莖上生有絨毛，因此攜有的病菌及微生物較多，在消毒過程中很難徹底除掉，如果消毒時間過長則發(fā)生褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。所以為了保證較高的存活率，用升汞滅菌時間不能過長，從而導(dǎo)致污染率提高[5]。選用越橘單芽作外植體可降低污染率并能有效提高啟動率。

本試驗(yàn)采用兩種方法針對單芽和莖段兩種外植體，與董朝莉研究結(jié)果比較，75%酒精浸泡莖段延長1 min，75%酒精浸泡單芽延長至30 s；0.1%升汞浸泡單芽縮短至8 min效果好[6-7]。試驗(yàn)中用莖段作外植體接種培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有部分分化形成愈傷組織，但生長很慢，所得苗生長細(xì)弱。而以單芽為外植體接種培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在愈傷化的同時，保持有強(qiáng)烈的分生能力，產(chǎn)生叢生芽，可以不經(jīng)過愈傷組織脫分化階段和壯苗培養(yǎng)階段，所獲得的叢生苗質(zhì)量好，莖葉粗壯，從而簡化培養(yǎng)程序，因此，用單芽作為外植體較用莖段為外植體繁殖篤斯越橘具有快速、高效特點(diǎn)。

4 結(jié)論

枝條經(jīng)過室內(nèi)水培和10℃處理后，以單芽作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，伸長生長效果明顯，可減少褐變的發(fā)生，增大芽體的存活率。

莖段及單芽的離體增殖生長的最適宜培養(yǎng)基為：WPM+1.5 mg·L-1ZT+0.3 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂。最佳培養(yǎng)條件為pH 5.4，光照時間為每日8h，培養(yǎng)溫度為25℃/15℃（日/夜）。

生根培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為1/2WPM+0.1 mg·L-1IBA+1.5 mg·L-1IAA+15 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂。最佳培養(yǎng)條件為pH 5.6，光照時間為每日8 h，培養(yǎng)溫度為25℃。

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