16個高叢越橘品種VcCBF基因的單核苷酸多態性（SNP）分析

王甲威，林 科，姜 超，魏海蓉，劉慶忠*

（1.山東省果樹研究所，山東省果樹生物技術育種重點實驗室，山東 泰安 271000；2.泰山學院生物與釀酒工程學院，山東 泰安 271021）

CBF基因（又稱DREB1基因），編碼一個具有AP2-domain的轉錄激活子，能夠結合到DNA上具有 CRT（C-repeat）或 DRE（Dehydration-responsive element）調節位點的位置，調節植物冷適應相關基因表達[1]。CBF基因是植物冷適應及信號傳導領域最有意義的發現之一，在多種重要農作物及蔬菜中均發現該基因，進一步研究發現，多種與植物冷適應相關的基因都受其調控[2-4]。國外學者在高叢越橘（Highbush blueberry，Vaccinium corymbosum）和兔眼越橘（Rabbiteye blueberry，Vaccinium virgatum）中也克隆到越橘的CBF基因，通過試驗驗證其功能，研究發現CBF基因表達量和表達模式的差異可能與高叢越橘品種藍豐（Bluecrop）和兔眼越橘品種梯芙藍（Tifblue）的抗寒性不同相關[5]。

單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因組水平上由單核苷酸變異所引起的一種序列多態性[6]。在所有可能的DNA序列差異性中，單核苷酸多態性是發生頻率最高的變異。在人類的DNA序列多態性中，90%序列多態性都是單核苷酸多態性[7]。單核苷酸多態性具有數量大、分布廣、穩定性強、易于分型等優點，在人類疾病診斷及治療、致病基因的發現、族群演化研究等方面起重要作用，同時在小麥、玉米、大豆等作物的物理作圖、進化研究、遺傳研究中也是很有效的分子標記[6,8-13]。

本研究以16個抗寒性不同的高叢越橘品種為試材，克隆其CBF基因，采用直接測序法篩查VcCBF基因的單核苷酸多態性，以期為研究VcCBF基因與越橘抗寒性的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 高叢越橘品種

研究采用的16個高叢越橘品種采自山東省果樹研究所越橘品種資源圃，分別為北陸（Northland）、喜來（Sierra）、陶柔（Toro）、都克（Duke）、日出（Sunrise）、藍豐（Bluecrop）、埃利奧特（Elliott）、達柔（Darrow）、藍塔（Bluetta)、澤西（Jersey）、布里吉塔（Brigitta）、早藍（Earliblue）、晚藍（Lateblue）、藍金（Bluegold）、瑞卡（Reka）和普魯（Puru）。

1.2 VcCBF基因的克隆、測序及單核苷酸多態性分析

以越橘幼嫩葉片為試材，采用TIANGEN植物基因組提取試劑盒提取基因組DNA，根據已發表越橘CBF基因序列設計引物，進行PCR擴增，擴增所用的上游引物為5'GAATCGTCGATGGAATATA ACT 3'，下游引物為5'TCTAAAATCTAACTCCACA ACG 3'，PCR產物回收后采用pMD18-T Vector載體（TaKaRa公司）連接，轉化DH5a感受態細胞，LB/Amp平板上培養過夜后挑取菌落進行菌落PCR篩選陽性克隆，陽性克隆測序由上海生工生物技術有限公司完成[14]。每個品種測序8個陽性克隆，所得序列采用DnaSP v5分析VcCBF基因的單核苷酸多態性[15]。

2 結果與分析

2.1 VcCBF基因的克隆

PCR所得目的片段長度為698 bp，PCR產物回收后連接轉化，將陽性克隆進行測序，對測序結果進行序列比對，除去重復序列，每個越橘品種得到4～8個序列，共得到94個非重復序列（見表1）。

表1 16個高叢越橘品種測序得到的VcCBF基因非重復序列Table1 Non repetitive sequences of VcCBF gene in 16 highbush blueberry cultivars

2.2 VcCBF基因的單核苷酸多態性

將所得VcCBF基因編碼區（全長681 bp）的94個非重復序列利用DnaSP軟件進行單核苷酸多態性分析，共發現103個SNP，全部為單核苷酸的替換，并沒有InDel情況發生，SNP發生頻率為1/619 bp，核苷酸多態性值（Pi）為0.01274。在103個SNP中，單態突變位點（Singleton variable sites）52個，簡約信息位點（Parsimony informative sites）51個，在簡約信息位點中，雙突變為50個，三突變為1個（見表2）。

表2 16個高叢越橘品種VcCBF基因的單核苷酸多態性類型Table2 SNPs type of VcCBF gene in 16 highbush blueberry cultivars

進一步對VcCBF基因單核苷酸多態性堿基替換方式進行分析（見表3），除去三突變的簡約信息位點后，在剩余的102個SNP中，轉換（A?G，T?C）共有83個，顛換（G?T，A?C，C?G，A?T）共有19個，轉換與顛換的比率為4.37∶1。

2.3 VcCBF基因的單倍型分析

對來自同一品種不同克隆的非重復序列進行組裝，得到一致序列。利用DNAStar Megalign軟件分別對來自不同材料的序列進行多序列聯配，分析其單倍型，結果見圖1。組裝得到一致序列后，通過序列聯配，這16個越橘品種可分為5種單倍型（Haplotype），且不同品種的越橘單倍型差異較大。

表3 VcCBF基因的堿基替換方式Table3 Substitution types of bases in SNPs

圖1 16個高叢越橘品種VcCBF基因的單倍型關系Fig.1 VcCBF gene haplotype of 16 highbush blueberry cultivars

3 討論與結論

檢測單核苷酸多態性的方法很多，直接測序法是篩查SNP最可靠的方法之一，特別是對基因組信息較少、分子生物學研究較少的物種而言。本研究通過對16個越橘品種VcCBF基因的克隆測序，得到94個非重復序列，測序總長度63 732 bp，在VcCBF基因的編碼區共發現103個多態性位點，單核苷酸多態性發生頻率為1/619 bp，核苷酸多態性值（Pi）為0.01274，相對于其他物種，VcCBF基因單核苷酸多態性頻率較低，這可能與其受到的選擇壓力較大相關。通過對103個SNP的具體分析，發現單態突變位點52個，簡約信息位點51個（其中雙突變50個，三態突變1個），在堿基轉換方式分析中發現轉換共有83個，顛換為19個，轉換與顛換的比率為4.37∶1。通過進一步組裝一致序列，進行單倍型分析，在16個越橘品種中共有5種單倍型。

直接測序法篩查SNP也存在不足，首先在克隆和測序過程中會造成假陽性，在檢測到的52個單態突變位點中可能存在克隆或測序錯誤造成的誤差。此外，高叢越橘品種為四倍體，且多為雜交選育而來，其本身VcCBF基因的情況較為復雜，本研究從每個品種篩選8個陽性克隆進行測序，可能造成其內源VcCBF基因的缺失，從而對分析其單核苷酸多態性和單倍型造成不足，這也是多倍體植物中單核苷酸多態性開發的難點之一[16]。多倍體植物中單核苷酸多態性開發的另外一個難點就是區分品種內的多態性和品種間的多態性，如普通小麥（異源六倍體），以26個品系為材料，采用直接測序法篩查其21個基因的SNP，結果發現大部分的SNP是品種內的多態性，品種間的多態性數量較少[17]。

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