環氧合酶2-1195G>A基因多態性和腫瘤風險的meta分析

顧玲，高天翼，宋國齊，李瑞，許曄瓊，陳麗萍，聶珍琳，王書奎

1.南京師范大學 生命科學學院；2.南京醫科大學附屬南京第一醫院中心實驗室，江蘇 南京 210006

0 前言

腫瘤是一種與遺傳和環境有關的多因素疾病。遺傳突變會影響基因的轉錄以及下游產物的表達水平，基因過表達引起基因拷貝數的增加可能會使機體易發生腫瘤[1]。因此，基因與環境的相互作用在腫瘤的發生過程中發揮了重要作用。人類的環氧合酶2位于1號染色體q25.2～q25.3，長度約7.5 kb[2]，包含10個內含子和11個外顯子。環氧合酶2作為炎癥因子，參與人體的許多病理生理過程，包括炎癥發生、細胞增殖、腫瘤發生和血管形成[3-6]。環氧合酶2的過表達可以促進腫瘤血管生成、抑制細胞凋亡、增強腫瘤的侵襲能力及誘導腫瘤的免疫耐受。與此同時，越來越多的動物實驗證據表明選擇性的環氧合酶2抑制劑可以減少腫瘤發生。目前，人們研究認為，環氧合酶2 -1195G >A的突變導致啟動子區增加了c-MYB 的結合位點，c-MYB與此位點的結合增強環氧合酶2的轉錄和表達活性[7]。近年來，諸多研究結果顯示人體許多器官的腫瘤包括淋巴癌[8-9]、結腸癌[10-15]、食道癌[6,16-19]等均發現伴隨-1195G > A 的突變，但研究結論卻不一致。為驗證環氧合酶2-1195G > A與腫瘤的發生是否存在相關性，我們在此收集可靠數據，通過meta分析求證兩者之間的關系。

1 資料與方法

1.1 搜索策略

使用Pubmed網站上的主題詞“環氧合酶2”“多態性”和“腫瘤”搜索相關文獻。搜索的限制條件為英文文獻，研究對象為人類。此外，通過對參考文獻進行人工搜索以篩選符合條件的文章。若是不同文章研究對象相同或較小的研究樣本是較大研究的一部分，我們只選擇較大人群的研究和最新的研究。此篇研究的納入排除標準為：① 環氧合酶2-1195G > A突變與腫瘤的相關研究；② 病例對照研究；③ 可以在文獻中提取到有關基因型的數據。

1.2 數據提取

所有數據由兩位工作人員分別提取、整理，并核對無誤后方可用于數據分析。對于數據中有異議的地方須雙方協調達成一致。對于每篇納入文獻，須提取的數據包括：第一作者、發表年限、種群、國家、病例對照組的基因頻率。對種群進行分層分析時，我們將其分為亞洲人群、歐洲人群及混合人群，其中混合人群為病例來源一個以上的種群 [6,8-18,20-31]。

1.3 統計方法

計算對照組中G等位基因頻率以檢驗樣本的群體代表性。各組之間的一致性采用χ方檢驗，顯著性水準為P<0.05。環氧合酶2與腫瘤之間的相關性用OR值與95%CI表示。總體研究中，我們對AA、AG基因型與野生型GG做了比較；AA合并AG基因型與GG以及AA與AG合并GG的基因型分別進行了對比分析，此外我們還對A突變基因的顯性模型和隱形模型分別做了分析。

通過Q檢驗分析各個文獻結果OR值的一致性，結果由P值決定。若P＞0.1代表各組之間一致性較好，那么OR則通過固定效應模型求得，否則采用隨機效應模型計算[32]。此外，我們對可能存在的混雜因素進行分層初步判斷數據異質性的來源。OR值通過Z檢驗確定其可信度。通過漏斗圖和Egger,s檢驗驗證數據是否存在發表偏移[33]。最后對數據進行敏感性分析以確定結果的穩定性。

1.4 主要方法

本文納入的文獻主要運用以下4種測序方法：

（1） 聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態性（PCRRFLP）：是用PCR儀擴增目的DNA片段，擴增產物用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，經過凝膠電泳，在凝膠成像與分析系統上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產生不同長度的DNA片段條帶。

（2） Taqman：Taqman熒光探針是一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光發射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，發射基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發射基團和淬滅基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增1條DNA鏈，就有1個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步，從而實現定量。

（3）直接測序法：利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套4個單獨的反應構成，每個反應含有所有4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千個堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后，可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

（4） TDI-FP：以特異探針及熒光素標記的ddNTP為底物，在DNA聚合酶及其緩沖液中循環雜交延伸后，應用熒光偏振技術可以測量平面偏振光激發后產生的水平和垂直的熒光。當熒光染料被平面偏振光激發后，發生熒光偏振，由于大分子比小分子旋轉得慢，熒光標記的Acyclo終止堿基摻入寡核苷酸引物下游后偏振值將增加，故由此來確定哪一種熒光標記的Acyclo終止堿基已被摻入整合。

1.5 主要儀器設備

2 結果

2.1 數據特征

按照搜索策略檢索文獻，最終搜索到120篇文獻。根據納入排除標準：其中有92篇因不涉及-1195G/A突變、2篇為非病例對照研究、1篇無基因型數據被排除。最終余下25篇文獻可用于meta分析[6,8-31]。

有關納入的25篇文獻的數據特征，見表1。在這25篇文獻中，有10篇文獻的研究對象為歐洲人群，12篇為亞洲人群，只有3篇報道為各人群混雜的美國人。各個研究的樣本容量范圍為107～1300，病例組和對照組的總樣本例數為9482和12206。對照組的基因分布頻率符合哈溫平衡。

2.2 數據質量

表1 納入本項研究的所有人群信息

對照組A等位基因的分布頻率在不同人群之間存在統計學差異。在亞洲人群中A等位基因頻率為0.46，顯著低于歐洲人群的0.75和混合人群的0.82。

在總的分析中，我們發現突變基因型與腫瘤發生在各個遺傳模型中均存在相關。純合子基因型AA vs GG（P=0.030，OR=1.23，95% CI：1.03～1.48, P =0.000），雜合子基因 AG vs GG（P=0.007，OR=1.13，95%CI：1.03～1.23，P=0.173）， 顯性模型 AA/AG vs GG（P=0.026，OR=1.15，95%CI：1.02～1.31，P=0.008），隱性模型 AA vs AG/GG（P=0.020, OR=1.14, 95%CI:1.02～1.28, P =0.000），見圖1。對人群進行分層，A/G的突變是亞洲人群發生腫瘤的危險因素，AA vs GG（P=0.001，OR=1.48，95%CI：1.18～1.86，P=0.000），AG vs GG（P=0.000，OR=1.20，95%CI：1.09～1.32，P=0.453），AA/AG vs GG（P=0.000，OR=1.28，95%CI：1.12～1.46，P=0.038），AA vs AG/GG（P=0.003，OR=1.33，95%CI：1.11～1.60，P=0.000）。同樣 ,在“其他”組中也發現了相似的結果, AA vs GG（P=0.013，OR=1.31，95%CI：1.06～1.63，P=0.084），AG vs GG（P=0.084，OR=1.12，95%CI：1.00～1.27，P=0.232），AA/AG vs GG（P=0.051，OR=1.15，95%CI：1.02～1.31，P=0.092），AA vs AG/GG（P=0.004，OR=1.22，95%CI：1.07～1.09，P=0.050）。按照腫瘤的類型分層，只在鼻咽癌中發現1個陽性結果。AG vs GG（P=0.018，OR=1.24，95%CI：1.04～1.49，P=0.038)，見表2。

圖1 Cox-2-1195G>A基因多態性與腫瘤風險的相關性

2.3 異質性分析

總體而言，病例對照組的純合子基因型AA、雜合子基因AG、顯性模型AA/AG、隱性模型AG/GG與純合子基因型GG之間存在異質性，P值分別為0.000、0.173、0.008、0.000。為了尋找組間異質性來源，我們對數據進行了分層分析，發現異質性主要來源為種群因素而非腫瘤類型的差異。

2.4 敏感性分析

敏感性分析發現文獻Kristinsson[18]和Vogel[25]是歐洲人群產生異質性的主要來源，移除這2篇文獻后再對數據分析，顯示異質性降低。同理，Uede[14]是亞洲人群異質性的來源。通過敏感性分析，發現沒有其他文獻會影響總OR值，表明數據的結果是可靠的。

2.5 發表偏倚

Begger’s 漏斗圖和Egger’s 檢驗用來檢測發表偏倚。漏斗圖形狀顯示所有的基因型無明顯不對稱性。當用Egger’s 檢驗檢測時，漏斗圖無不對稱性（AA/AG vs GG, P= 0.117），見圖 2。

圖2 AA/GG比GG模型發表偏倚檢測的Begger’s漏斗圖。每一點分別對應1個獨立的研究。Log [OR], 為OR值的自然對數。水平線，為平均效應大小。

3 討論

本次meta分析納入了25個病例對照研究，包括9428個病例和12206個對照，探討了環氧合酶2 -1195G＞ A基因多態性和腫瘤發病風險之間的關系。我們的研究發現所有不同的基因型均能增加腫瘤的發病風險。

表2 Cox-2-1195G>A基因多態性和腫瘤風險的分層分析

環氧合酶2的過表達可影響腫瘤細胞的腫瘤性基因特征，如誘導抵抗細胞程序性死亡，調節胞外矩陣粘附力，促進血管生成，增加轉移潛能和影響抗癌效果等[34-39]。近來，有研究發現基因多態性-1195G＞A產生了一個c-MYB結合位點，從而提高了環氧合酶2基因的轉錄活性。c-MYB是一種在造血系統和胃腸道中有活性的轉錄因子，作用于多種基因調節細胞分裂、分化和生存過程中的精細平衡[40]，進一步證明了-1195G>A的多態性可能改變個體對腫瘤的易感性。但是，也有研究報道了-1195G的等位基因可降低腫瘤的發病風險[13]。為了解決這一矛盾，我們對所有合乎條件的病例對照研究運用meta分析來評估其相關性。

我們的研究發現，-1195G>A的基因多態性在亞洲人群中顯示與腫瘤相關，但在歐洲人群和混雜人群中未發現相關性，有遺傳背景的種族差異以及居住環境可能是引起這種現象的原因[41]。比如，對照組中亞洲人G等位基因頻率為0.46，在歐洲人群中，這一數值卻為0.75，隨后，獨立樣本的t檢驗顯示這兩者之間存在顯著差異。腫瘤是一種多因素的復雜疾病，環氧合酶2-1195G＞A變異對腫瘤發展的影響可能還與一些暫未發現的基因有關。入選標準的不同和選擇偏倚等因素，也對結果產生影響。上述原因都可以導致結果的不一致性。未見非洲人群-1195G>A的基因多態性研究，所以這種種族差異可能是由于樣本量較小產生的。因此，需要更多的研究特別是在非洲人群中的研究來進一步證實，種族差異在基因多態性與腫瘤的發病風險關系中是否起作用。

根據腫瘤類型進行分層分析，結果顯示除了AG基因型的食管癌外，-1195基因型并沒有增加腫瘤的發病風險。對于-1195A等位基因是否增加食管鱗狀細胞癌的風險，各個研究結果間存在著差異[6,42-43]。Guo等[42]、Zhang等[6]、Hu等[19]的研究顯示環氧合酶2-1195G＞A與增加中國人群中的食管鱗狀細胞癌風險明顯相關，且環氧合酶2的遺傳性變型可能影響食管癌的易感性。但是，Kristinsson等[18]研究指出Cox-2-1195GG基因型和AG/GG基因型增加了食管癌的風險。Moons等[17]論證了只有環氧合酶2AG純合子能增加食管癌的風險，該結論與我們研究的結果一致。不同的研究結果提示可能有多種因素參與基因多態性的調節。事實上，吸煙[44]、幽門螺旋桿菌[19]、喝酒[45]、非甾體類抗炎藥[45-49]及種族差異均與食管癌相關，而且這些因素也可能與環氧合酶2基因型存在交互作用，或者可能是統計的混雜因素。然而，上述的研究中未完全包含這些因素，需要更多的研究進一步探討各基因型與這些因素之間的關系。在結直腸癌的研究中，只有一個報道[15]了-1195G>A等位基因與中國人群結直腸癌有關，其余研究均未發現陽性相關。鑒于這一亞洲人群中唯一的陽性結果，需要我們進行大樣本的研究來驗證其結果。在“其他”項的研究中，將一些單個獨立的研究合并后，其OR值顯示-1195G>A基因多態性與腫瘤發病風險相關。對于不同類型腫瘤，-1195G>A基因多態性可能作用不同。即使相同部位的腫瘤中，由于遺傳的基因多態性對腫瘤的影響，再加上一些研究的樣本量相對較小，所以一些較小的聯系在這些研究中就不會檢測出來，從而導致研究結果的不一致性。將單個或不同類型的腫瘤合并后，選擇偏倚會對統計結果產生很大的影響。比如，關于淋巴瘤的研究只有兩個，樣本量有限，所以在對其結果下結論時需謹慎。需要更多前瞻性的研究來評估環氧合酶2過表達與疾病間的關系。

本次meta分析仍存在一定的局限性：① 所有納入的文獻都是英文的，可能漏掉了一些用其他語言發表的合適的研究；② 總結果為各個研究未經矯正的OR值計算而來，一些潛在的混雜因素需被校正（如年齡、性別、吸煙和環境因素等）；③ 可能存在誤分類而影響分析結果；④ 出版偏倚，可能有合適的研究還未在線發表或出版。

本研究的優勢：① 在盡可能多的研究中提取數據，大大增加了本研究的效力；② 符合納入標準的病例對照研究質量良好；③ 在我們的研究中未發現發表偏倚，使得結果更可信。

總之，本研究發現環氧合酶2-1195G＞A基因多態性與總人群的腫瘤發病風險有關，在亞洲人群中更為顯著。遺傳分布的種族差異起了很大的作用。環氧合酶2-1195G＞A基因多態性可能觸發環氧合酶2的過表達從而誘導腫瘤的發生。需要進一步運用蛋白水平的研究來闡明基因多態性在腫瘤發生過程中的影響，以及基因-基因、基因-環境間的交互作用等。

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