Bio－Gide生物膜與人牙周膜干細胞的生物相容性研究

楊 昊，魯 紅，陳發明，金 巖

(第四軍醫大學口腔醫學院，陜西西安710032)

牙周病治療中牙周缺損的修復是國際關注的難題。傳統的牙周治療方法雖然能有效控制牙周病的發展進程，但卻不能使缺失的牙周支持組織再生。自2004年美國施松濤教授發現人牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)以來，使干細胞治療為牙周組織再生帶來了新的希望，有望成為未來牙周病治療的重要手段［1］。而引導組織再生術(guide tissue regeneration，GTR)作為牙周病治療的主要方法［2］，是在牙周手術中利用膜性材料作為屏障，阻擋牙齦上皮在愈合過程中沿根面生長，引導具有形成新附著能力的牙周膜細胞(periodontal ligament cells，PDLCs)優先占領根面，形成新的附著性愈合。由此可見:生物膜材料的阻擋作用和生物相容性對GTR具有重要影響［3］。Bio－Gide生物膜是瑞士Geistlich Pharma AG集團有限公司的產品，已經在臨床上得到廣泛應用，其為組織再生提供空間的機械屏障作用已被充分認可［4－6］，但作為細胞載體材料，特別是與PDLSCs的結合及其附著能力的研究尚少，而細胞載體的研究在牙周組織工程研究中具有重要的地位和作用［7］。考慮到該材料具有長期臨床應用的基礎，如果能夠將其作為細胞載體，應用于牙周組織工程和細胞治療中，將加速臨床轉化的進程。為進一步開發Bio－Gide在牙周再生醫學中的應用，本研究通過觀察人PDLSCs在Bio－Gide生物膜材料上的粘附生長情況，為其作為有效的細胞載體用于牙周組織工程治療提供實驗室依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、試劑和儀器

Bio－Gide生物膜(Geistlich Pharma AG，瑞士);α－MEM 培養基、L－谷氨酰胺、青、鏈霉素、(Gibco公司，美國);胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程有限公司);2.5 g/L胰蛋白酶(Amresco，美國);Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國);地塞米松、β－甘油磷酸鈉、異丁基甲基黃嘌呤IBMX、抗壞血酸(Sigma，美國);抗 CD31、抗 CD34、抗 CD45、抗 CD90、抗CD105、抗 CD29、抗 CD146、抗 STRO－1 抗體(R＆D Systems，美國);茜素紅、油紅O、二甲基亞砜DMSO(Sigma公司，美國)。二氧化碳恒溫培養箱(ThermoForma，美國);離心機 (Kubota2l00，日本);YJ－875型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠);倒置相差顯微鏡和照相系統(OlympusIX70，日本);體視顯微鏡(Olympus，日本);掃描電鏡(日立 S－4800，日本);6孔培養板、24孔板、平底96孔板(Falcon，美國);10 cm直徑細胞培養皿(Corning，Lowell，美國);流式細胞儀(Beckman Coulter，Fullerton，CA，美國);超聲震蕩儀(上海生源器械廠);酶聯免疫檢測儀(BIO－TEK，美國);紫外線分光光度儀(Eppendorf，德國)。

1.2 人牙周膜干細胞的分離培養和鑒定

1.2.1 牙周膜干細胞的原代培養

選取5名年齡16～45歲健康(否認全身性疾病)志愿者(知情同意)拔除無牙周病的第三磨牙(上頜4個，下頜5個)，立即在超凈工作臺內刮取根中1/3牙周膜組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm并移入離心管內，以 I型膠原酶在37℃下消化15 min后接種于6孔板中，置蓋玻片并滴加含100 mL/L FBS的 α－MEM培養基，置 37℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下培養10～15 d，每2天換液1次。待細胞從組織塊邊緣爬出并達到80%匯合時，2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 牙周膜干細胞的分離、純化

有限稀釋法克隆分離PDLSCs:取上述細胞用α－MEM制成單細胞懸液，調整細胞密度為10/mL以下，接種于 96孔板，每孔 0.1 mL，在 37℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下常規培養24 h，待細胞貼壁后顯微鏡下觀察并標記含單個細胞孔，補加0.1 mL培養基繼續培養，每隔2天換液。當細胞形成克隆(集落細胞數≥50)并長至孔底1/2時，胰蛋白酶消化，擴大培養，即為PDLSCs。

1.2.3 PDLSCs的鑒定

1.2.3.1 細胞克隆形成能力的檢測

取克隆純化的第4代細胞用胰酶消化后用α－MEM制成單細胞懸液，以1×103個細胞接種于10 cm的培養皿中，十字方向輕輕晃動培養皿，使細胞分散均勻后置37℃的CO2孵箱中常規培養。14 d后，棄去培養液，用PBS洗2遍，40 g/L多聚甲醛室溫固定30 min，PBS浸洗2遍，甲苯胺藍染色20 min，PBS洗2遍，顯微鏡下觀察并拍照。以多于50個細胞的集落計為一個克隆，并計算克隆形成率。

1.2.3.2 細胞生長曲線測定

取克隆純化的第4代細胞用胰蛋白酶消化后用α－MEM制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×104/mL后接種于 96 孔板，每孔 200 μL，置37℃，50 mL/L CO2孵箱中常規培養。24 h后每孔加5 mg/mL的MTT液20 μL繼續培養4 h，棄去上清液，每孔加160 μL DMSO振蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀測各孔490 nm處的吸光值(OD值)。并以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.3.3 干細胞表面標志物檢測

取克隆純化的第4代細胞胰酶消化后用α－MEM制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×106/mL后用含30 mL/L FBS的PBS洗2遍，裝入EP管中，分別加入適當量的 CD90、CD105、CD29、STRO－1、CD146、CD31、CD34、CD45 抗體于4℃冰箱中孵育。1 h后用含3 mL/L FBS的PBS洗去抗體，用流式細胞儀在避光條件下進行抗體檢測。其中STRO－1是Alexa Fluor647標記;CD45、CD146、CD90、CD31 為 PE 標記;CD105、CD29、CD34為FITC標記。

1.3 Bio－Gide生物膜的細胞毒性實驗

1.3.1 Bio－Gide 生物膜浸提液的制備

參照GB/T 16886.5醫療器械生物學評價第5部分細胞毒性試驗體外法，將Bio－Gide生物膜用Co60射線消毒后切成5 mm×25 mm，按3 cm2/mL的比例加入含100 mL/L的FBS的 α－MEM培養液，于37℃下浸提24 h，取浸提液用于以下實驗。

1.3.2 MTT 法測細胞毒性

取克隆純化的第4代細胞用胰蛋白酶消化后用α－MEM制成細胞懸液，調細胞密度為1×104/mL接種于 96孔板，每孔 200 μL，置 37℃、50 mL/L CO2的細胞培養箱中培養。24 h后棄原液，將細胞隨機分為2組，每組8孔，其中對照組加入200 μL的 α－MEM 培養液，實驗組加入200 μL的Bio－Gide生物膜浸提液，繼續培養至第5天時，于各組各孔加入20 μL MTT液，培養箱內繼續孵育4 h后棄上清液，每孔加160 μL的DMSO，低速震蕩10 min后用酶聯免疫檢測儀測各孔490 nm波長處的吸光度值(OD值)，記錄結果，實驗重復3次。以下列公式計算各組細胞的相對增殖率(RGR)。

并根據國家標準將RGR值轉換成6級反應(表1)，以評定材料的毒性程度:0、1級為合格;2級應結合細胞形態分析，綜合評價;3～5級為不合格。

表1 RGR值轉換6級反應標準

1.4 PDLSCs在 Bio－Gide生物膜上生長、粘附情況觀察

1.4.1 掃描電鏡觀察生長情況

將 Bio－Gide生物膜剪成1.5×1.5 cm 后置24孔板中。取生長狀態良好的第3代PDLSCs，胰蛋白酶消化并用α－MEM制成細胞密度為1×106/mL的細胞懸液后接種于生物膜片上常規培養，在培養后8 h、1、3、7、12 d 時中止培養，取生物膜片用固定液固定后，電鏡樣本制備常規掃描并觀察拍照。

1.4.2 熒光顯微鏡觀察細胞的粘附情況

將生物膜剪成1.5×1.5 cm后置24孔板中，同時設不放生物膜的孔作為對照，取生長狀態良好的第3代PDLSCs用含100 mL/L FBS的α－MEM制成細胞密度為1×106/mL的細胞懸液后接種于上述24孔板中，每孔1 mL，37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養，24 h后于各組各孔滴加Hochest熒光核染色劑，繼續培養30 min后，吸取上清液，熒光顯微鏡下觀察并進行細胞核計數(實驗重復8次)，以下列公式計算細胞粘附率。

1.5 統計學分析

使用SPSS 17.0軟件進行統計分析，組間比較用獨立樣本均數t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 人PDLSCs的分離培養與鑒定

本研究參照課題組前期報道［8］，采用酶消化組織塊法培養人PDLCs，一般10 d左右可見細胞從組織塊邊緣爬出，大約3周左右原代細胞達80%匯合。可見細胞呈長梭形，有細胞突觸，胞核聚集在中心，具有成體干細胞的特征(圖1)。培養皿內的細胞在7 d左右出現克隆集落，呈旋渦狀生長，集落內細胞密度隨時間逐漸增加，細胞形態為長梭形，細胞突起明顯(圖2)。14 d時計算克隆形成率為(12.9±0.6)%。細胞生長曲線基本成S形，第2天與第1天比較無明顯增殖，第3天開始基本成對數增長，第7天時細胞增殖進入平臺期(圖3)。通過對細胞表面抗原的檢測，對造血系標志物CD34、CD45和內皮系標志物CD31表達陰性;而高表達一系列干細胞表面標志物STRO－1、CD146、CD105、CD29、CD90(圖 4)。其中 STRO－1是 11.9%，CD146是 45.5%，CD105是 92.1%，CD29是99.5%，CD90是 100%，CD34是 0.7%，CD45 是1.9%，CD31 是0.2%。

圖1 牙周膜細胞原代培養10 d(×40)

圖2 14 d時單細胞克隆(×15)

圖3 MTT法檢測細胞生長曲線

圖4 流式細胞儀檢測細胞表面標記物

2.2 細胞毒性實驗

實驗組吸光度均值明顯高于對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05)，其增殖率 RGR=122.66%(表2)。根據表1評定標準其毒性級為0級，無毒性。

表2 細胞毒性實驗結果 (n=8)

2.3 掃描電鏡觀察PDLSCs在Bio－Gide生物膜上的生長情況

Bio－Gide生物膜的基本組成成分Ⅰ型和Ⅲ型膠原，電鏡下可見粗大的膠原纖維束(圖5a)。通過對生物膜上不同時段細胞的觀察，可看到細胞在生物膜上有很好的貼附生長，8 h觀察細胞在生物膜上已經附著并伸展呈長梭形及多角形，部分細胞成短梭形(圖5b)。而24 h細胞已經完成貼壁，視野中均為長梭形細胞，高倍鏡下可見細胞附著較密集，細胞與細胞間有空隙，可見下層的膠原束(圖5c)。3 d時細胞增殖較多，匯合成片狀，基本覆蓋細胞下方的膠原束(圖5d)，但在低倍鏡下仍可見不同的膠原層次(圖5e)。7 d時細胞已經完全成膜狀生長，低倍鏡下觀察，生物膜表面呈平滑狀，膠原束已經完全被細胞膜遮擋，膜表面可見細胞生長的片狀紋理，少數細胞膜片之間未完全融合留有裂隙(圖5f)。12 d時在低倍鏡下觀察細胞生長密集，形成的膜片較7 d時增厚，細胞膜片之間的裂隙也明顯減少(圖5g)。

2.4 PDLSCs在Bio－Gide生物膜上的粘附情況

將與生物膜共同培養的PDLSCs上清液用Hochest熒光核染色劑染色后，熒光顯微鏡下進行細胞計數，結果顯示:實驗組上清液中細胞數為(13.3±3.4)×104，其細胞粘附率為(86.7 ±3.4)%，明顯高于對照組(P ＜0.05)(表3)。

圖5 PDLSCs在生物膜上培養不同時間點掃描電鏡觀察

表3 PDLSCs在Bio－Gide生物膜上的粘附情況(n=8)

3 討論

牙周治療的最終目標，是實現牙周支持組織的功能性再生，傳統的治療方法雖能有效控制牙周病的發展過程，但卻不能達到牙周組織再生的目的。GTR技術的應用大大提高了牙周治療的臨床效果，但其與真正的牙周支持組織的生理性和功能性再生還有一定的距離。

近年來，組織工程的發展為牙周缺損的治療帶來了新的思路，其基本方法是將體外培養的高濃度、功能相關的活細胞種植于具有良好生物相容性和生物降解性的細胞外基質材料上，經過一段時間的培養，將這種細胞與生物材料復合體植入機體病損部位，以形成新的具有原來特殊功能和形態的相應組織和器官，達到修復創傷和重建功能的目的。而牙周膜干細胞的發現又為牙周組織工程的構建提供了理想的細胞來源。大量的動物實驗表明:利用牙周膜干細胞進行牙周組織的細胞治療，均能實現較為理想的牙周缺損組織的生理性和功能性再生［9－11］。而在利用組織工程技術進行牙周治療的過程中，細胞載體的運用起著重要的鏈接作用，但目前還沒有一種可供臨床應用的良好細胞載體，因此大大延緩了牙周組織工程(特別是細胞治療)基礎研究成果的臨床轉化進程。

在GTR和骨再生手術中得到廣泛應用的Bio－Gide生物膜是瑞士蓋氏骨替代品產品，該生物膜主要由致密層和疏松層組成。致密層主要是阻止軟組織長入植骨區域，疏松層主要是容納血細胞和成骨細胞，使骨膜能與植骨區更易貼合，更易新骨的形成。該材料良好的機械屏障作用已經得到認可，但目前還未見該材料作為細胞載體用于牙周組織再生的有關報道。因此，如能將GTR中的屏障膜作為細胞載體，特別是與PDLSCs結合用于牙周組織工程和細胞治療中，定將加速臨床轉化的過程。本研究通過觀察PDLSCs在Bio－Gide膜材料上的生長、粘附情況，證明該生物膜具有良好的生物相容性，無細胞毒性，能夠支持PDLSCs成膜性生長，有望成為良好的牙周組織工程細胞載體材料。

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