發酵條件對海帶中巖藻黃素提取率的影響

曲榮榮，張春枝

（大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

0 引言

巖藻黃素是可食用褐藻中一種主要的淡黃褐色的脂溶性類胡蘿卜素，它具有很長的共軛雙鍵，并含有丙二烯，乙酰基和環氧烷的特殊分子結構［1］。這些特殊的結構決定了巖藻黃素具有許多重要的生物活性，如抗癌［2-4］、抗炎［5］、減肥［6］以及提高免疫力［7］等。

在工業生產中利用微生物分泌的多種酶類破壞組織中的細胞結構，使細胞破碎，從而提高類胡蘿卜素產量的技術已有報道［8］。本實驗以新鮮海帶為原料，通過對海帶發酵條件的研究，求得一個比較優化的發酵工藝，以期在巖藻黃素的生產過程中提高產率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器設備

新鮮海帶，黑曲霉，米曲霉，納豆菌，乙醇。

722G 可見分光光度計，恒溫水浴鍋，臺式高速離心機，HZQ-F160全溫振蕩培養箱，766-5型遠紅外快速干燥箱，HH·BII·600-Ⅱ電熱恒溫培養箱。

1.2 種子液培養

1.2.1 黑曲霉和米曲霉種子液的培養

挑取2～3環活化的黑曲霉和米曲霉霉菌菌種，分別裝入50mL的查氏液體培養基于250mL的三角瓶（帶玻璃珠）中，28 ℃、160r/min搖瓶培養48h。

1.2.2 納豆菌種子液的培養

挑取2～3環活化的納豆菌菌種，裝入50mL的牛肉膏蛋白胨液體培養基于250mL 的三角瓶中，37 ℃、150r/min搖瓶培養24h。

1.3 固體發酵

1.3.1 發酵菌種的選擇

采用實驗室活化的3種不同的菌種：黑曲霉、米曲霉和納豆菌，分別在各自的最適生長溫度下對新鮮海帶進行發酵，其流程如下：

新鮮海帶粉碎→稱取一定量海帶→接種培養→取樣→干燥（40 ℃）→研磨→提取→測吸光值。

1.3.2 發酵時間的優化

新鮮的海帶渣接入8%的納豆菌，在37 ℃的條件下發酵1、2、3、4、5d，提取后測吸光值。

1.3.3 發酵溫度的優化

新鮮的海帶渣接入8%的納豆菌，分別在25、30、35、37、40、45 ℃的條件下發酵3d，提取后測吸光值。

1.3.4 接種量的優化

新鮮的海帶渣分別接入2%、4%、6%、8%、10%的納豆菌，并在37℃的條件下發酵3d，提取后測吸光值。

1.4 巖藻黃素提取率測定［8］

稱取適量的發酵海帶干粉，用60%的乙醇溶液，在50 ℃的條件下，以料液比1∶10 浸提1.5h，離心，取上清液，在445nm 下測吸光值。

式中，A445為樣品在445nm處的吸光值；A11cm為在1cm 光程長的比色皿中1g/L 巖藻黃素的理論吸收值，即1 600；n為稀釋倍數；V為提取液總體積，mL；m為樣品質量，g。

1.5 不同處理方法對巖藻黃素提取率的影響

將海帶原料分別進行3種不同的處理，即不采取任何處理；采用40 min、50 Hz超聲波法處理；采用最佳發酵條件發酵處理。然后用分光光度法分別測其巖藻黃素的提取率。

2 結果與討論

2.1 發酵菌種的選擇

由于巖藻黃素是一種極不耐熱的物質，所以原料不采取滅菌處理。本實驗將新鮮海帶分別接入相同量的黑曲霉、米曲霉和納豆菌在各自最適溫度下培養，其巖藻黃素提取率見表1。

表1 不同菌種發酵后巖藻黃素提取率的比較Tab.1 The comparison of fucoxanthin extract rate by different microbial strain after fermentation

由表1可見，不接菌的海帶原料中巖藻黃素提取率隨著天數的延長而增加，這可能是由于海帶中原有的微生物經生長繁殖后參與了發酵過程，從而導致巖藻黃素提取率的升高。

從發酵菌種來看，納豆菌發酵的海帶中巖藻黃素提取率較黑曲霉和米曲霉處理的均有所升高，因此納豆菌為最佳發酵菌種。

2.2 發酵時間對巖藻黃素提取率的影響

發酵時間對固態發酵的活菌數有較大影響。發酵時間過短，細菌菌體沒有充分形成，活菌數比較少；發酵時間過長，不僅菌體活力會下降，而且菌體還會自溶死亡，使活菌數降低，對發酵不利。由圖1可見，納豆菌發酵3d后，巖藻黃素提取率達到最大值，發酵3d后有小幅下降。因此選擇3d為海帶固態發酵的最佳時間。

圖1 發酵時間對巖藻黃素提取率的影響Fig.1 Effect of fermentation time on fucoxanthin extraction rate

2.3 發酵溫度對巖藻黃素提取率的影響

對于同一微生物來說，不同的生理生化過程有著不同的最適溫度，而溫度又是微生物生長代謝的重要條件，因此在發酵系統中必須保證合適的溫度環境。由圖2可見，溫度從25℃不斷上升時，巖藻黃素的提取率不斷增加，當上升至37 ℃時達到最大值，然后隨著溫度的上升，巖藻黃素提取率開始急劇下降。可見，發酵溫度為37 ℃較好。

圖2 發酵溫度對巖藻黃素提取率的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on fucoxanthin extraction rate

2.4 接種量對巖藻黃素提取率的影響

由圖3可見，在相同發酵條件下和接種量為2%～8%范圍內，巖藻黃素提取率隨接種量的增大而增大，且在接種量為8%時，巖藻黃素提取率達到最大，此后開始下降，說明接種量大于8%時不利于納豆菌的固態生長和發酵。因此本實驗的最佳接種量為8%。

圖3 接種量對巖藻黃素提取率的影響Fig.3 Effect of inoculum volume on fucoxanthin extraction rate

2.5 不同處理方法對巖藻黃素提取率的影響

由圖4可見，超聲波處理過的海帶較不經處理的海帶巖藻黃素提取率有所升高，說明通過破壁方法能夠使巖藻黃素得到更有效的提取，發酵后的海帶較未經處理的海帶巖藻黃素提取率明顯提高，其提取率增加了1.05倍，因而發酵法是一種提高巖藻黃素提取率的有效方法。

圖4 3種不同處理方法對巖藻黃素提取率的比較Fig.4 Comparison of three different treatment methods on fucoxanthin extraction rate

3 結論

（1）海帶中的巖藻黃素經納豆菌發酵的提取率較黑曲霉和米曲霉均有所升高，因此采用納豆菌為最佳發酵菌種。

（2）通過本實驗得出納豆菌固態發酵海帶的最適條件為：接種量8%，37 ℃固態發酵3d。

（3）經納豆菌發酵后海帶中的巖藻黃素提取率為1.03mg/g，與直接提取法相比巖藻黃素提取率明顯增加，且增加了1.05倍。