文心蘭原球莖生長和分化過程中酶活性和可溶性蛋白的變化

尤海波

（黑龍江省農科院園藝分院，哈爾濱150069）

在離體培養過程中，自Galston等［9］1969年最早研究煙草髓部愈傷組織的分化與過氧化物同工酶的關系以來，人們在這一領域進行了許多研究，發現外植體的生長、脫分化、分化與過氧化物酶活性、可溶性蛋白含 量 及其 同 工 酶 等 的 變 化 有 關［5－6，8，12］。 但 是 這 些 研 究主要集中于器官發生途徑和體胚發生途徑。原球莖（Protocorm－like bodies，簡稱PLBs）作為蘭科植物的一種特殊再生方式，在其形態發生過程中以上物質必然有其特定的代謝與變化規律。本試驗研究了文心蘭原球莖分化芽和根系過程中抗壞血酸過氧化物酶（APX）、愈創木酚過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和多酚氧化酶（PPO）活性以及可溶性蛋白含量的變化，為研究原球莖的生長或分化機理提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

黑龍江省農科院園藝分院組織培養中心培養的文心蘭（Dendrobium officinale）原球莖，經兩次繼代培養達到生長旺盛狀態時，再挑選處于同一生長時期、沒有分化的原球莖轉入培養基1／2MS＋BA5＋NAA 0.3，每瓶均轉入上述原球莖10g，每個處理各5瓶。培養基pH5.6～5.8，培養溫度（25±1）℃，每日光照12 h，光照強度1600～2500lx，分別與接種后的0d、7d、14d、21d、28d取樣，進行生理指標的測定（每個試驗重復3次）。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶液制備及酶活性測定。分別準確稱取不同生長時期的原球莖及不定芽新鮮材料0.3g，冰浴研磨，加入 PBS（pH7.8）緩沖液1.6mL，充分混勻，12000r／min離心30min，立即取上清液測定。可溶性蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍G－250比色法［7］；POD活性測定采用氧化愈創木酚法［2］，以每分鐘每單位質量吸光度值的變化表示（ΔOD·mg－1FW·min－1）；CAT活性采用過氧化氫氧化法測定［2］，以每分鐘OD值減少0.01為一個酶活性單位（U·g－1FW·min－1）；SOD活性測定采用 NBT光還原法［2］，以抑制NBT光化還原50%的酶量為一個酶活性單位（U·g－1FW）。上述實驗均重復3次。

1.2.2 可溶性糖含量測定。分別準確稱取不同發生時期的原球莖及不定芽的新鮮材料0.3g，剪碎，放入20mL刻度試管中，加5mL去離子水，管口封膜，沸水浴10min，流水冷卻，過濾至25mL容量瓶中，反復漂洗殘渣及試管，蒸餾水定容至刻度。采用蒽酮比色法［2］測定可溶性糖含量。實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 文心蘭原球莖不同發育時期酶活性變化

圖1 文心蘭原球莖不同發育時期APX變化

圖2 文心蘭原球莖不同發育時期POD活性變化

圖3 文心蘭原球莖不同發育時期CAT活性變化

圖4 文心蘭原球莖不同發育時期SOD活性變化

如圖1～圖4所示，在原球莖分化芽的過程中，APX、POD的活性均急劇下降，隨著芽的繼續生長，APX和POD的活性繼續降低；根系一旦被誘導，又呈上升趨勢，但活性均低于類原球莖期的水平；而CAT的活性在PLB分化芽后降到最低水平，隨著芽的生長活性緩慢升高，在根分化完成后活性再略有升高，變化趨勢與APX和POD大致相同。SOD與APX、POD、CAT的活性變化則呈現完全相反的變化趨勢。在類原球莖時期處于相對較高的水平，芽的分化伴隨SOD活性的增強，但隨根的分化和生長，活性呈現接近直線降低的趨勢，在根繼續生長時，SOD的活性接近于0。

2.2 多酚氧化酶（PPO）活性的變化

如圖5所示，在類原球莖分化芽的過程中，PPO的活性呈明顯的下降趨勢。在芽不斷生長的過程中，活性繼續降低，生根前降到最低，生根后活性回升，且隨根系伸長，酶活性繼續增強。

圖5 文心蘭原球莖不同生長時期PPO活性的變化

2.3 可溶性糖和可溶性蛋白質含量變化

圖6 文心蘭原球莖不同生長階段可溶性糖含量的變化

圖7 文心蘭原球莖不同生長階段可溶性蛋白含量的變化

圖6顯示，文心蘭原球莖可溶性糖含量在其發生過程中總體呈現先升高后降低的變化趨勢，并在根生成時達到最大值，文心蘭原球莖可溶性糖在芽和根的分化時期累積較多，并在根生長期出現最大峰值，這為細胞連續分裂和發育提供了物質和能量基礎，也為原球莖分化為幼苗提供物質和能量儲備。

由圖7可知，在文心蘭原球莖發生過程中，其可溶性蛋白質含量芽分化期急劇增加，在根形成期達到最大值。芽生長期和根形成期的可溶性蛋白質含量差異不顯著。從整個培養過程來看，芽和根形成期可溶性蛋白質含量急劇升高，這表明在原球莖分化初期，原球莖需要合成大量蛋白質來啟動芽的發生；而根形成期可溶性蛋白質累積較多，這為苗的進一步發育提供了物質基礎。

3 討論

原球莖是許多蘭科花卉最重要的離體無性繁殖的中間體，對其生長和分化的調控是蘭花試管無性繁殖研究的重要內容。已有的大量研究均是圍繞著外部因子，如培養基的成分和激素組合等開展，而對原球莖整個生長和分化過程中內在的生理生化變化的研究卻未見有系統的報道。

本試驗表明，原球莖分化芽的過程中，APX、POD、CAT和PPO的活性均呈急劇下降，在根發生后逐漸回升。劉玉艷等研究表明［3］，POD和PPO活性下降直接或間接調控IAA的水平，促進根原基的發生；而根原基發生后POD和PPO的活性又有所提高，可能與生根輔助因子“IAA－酚酸復合物”的產生、H2O2參與細胞壁形成、木質素單體的聚合有關。由于POD和PPO的活性變化均早于根的形態發生，一方面說明根發生的生理生化變化先于形態發生，另一方面也證實了POD和PPO是誘導根原基產生的關鍵性酶，可以作為鑒定根形態發生與否及生根難易的重要的生理指標［7，11］。

從可溶性蛋白的含量變化過氧化物酶同工酶具有調節植物內源激素IAA合成的功能［9］。在蘋果、獼猴桃等植物上的研究已表明，不定芽分化和根的發生與過氧化物酶（POD）活性及過氧化物酶同工酶的變化密切相關［4，10］。在本試驗也證實了過氧化物酶同工酶在類原球莖分化芽和根的過程中存在明顯的變化。表明有可能通過在培養基中有針對性地添加該類酶的促進或抑制劑來調控類原球莖的生長或分化，使石斛蘭的試管繁殖的各個環節有序地展開。

［1］ 侯大強，柴明良，莊曉英.春石解蘭類原球莖分化過程中抗氧化酶活性和可溶性蛋白的變化［J］.核農學報，2006，20（3）：248－251.

［2］ 李合生.植物生理生化實驗原理和技術［M］.北京：高等教育出版社，2000.

［3］ 劉玉艷，于鳳鳴，于娟.IBA對含笑扦插生根影響初探［J］.河北農業大學學報，2003，26（2）：25－29.

［4］ 馬鋒旺，李嘉瑞.蘋果新梢離體不定根形成期間某些生理變化的研究［J］.西北農業學報，1995，4（1）：80－83.

［5］ 田敏，韓凝，邊紅武，等.草莓愈傷組織再生能力與活性氧代謝水平相關性研究［J］.園藝學報，2004，31（3）：372－374.

［6］ 莊東紅，杜虹.大白菜子葉培養過程中POD同工酶和可溶性蛋白質含量的變化［J］.汕頭大學學報（自然科學版），2002，17（1）：64－73.

［7］ 張超，王廣東.文心蘭原球莖形態發生與可溶性物質及抗氧化酶的關系［J］.西北植物學報，2009，29（8）：1607－1613.

［8］ Chandru H K，Kim E，Kuk Y，et al.Kinetics of wound－induced activation of antioxidative enzymes in－Oryza sativa：differential activationat different growth stages［J］.Plant Sci，2003，164：935－941.

［9］ Galston A W，Davies P J.Hormonal regulation in higher plants［J］.Science，1969，163（873）：1288－1297.

［10］ Gasper T，Penel C，Castillo F J.A two step control of basic acidic peroxidases and its significance for growth and development［J］.Physiol.Plant，1985，64：418－424.

［11］ Hausman O B，Potter J R.Rooting of apple，Rhododendron，andmountainlaurelcutting from stockplants etiolated under two temperatures［J］.Hortscience，1997，32（2）：304－306.

［12］ Rajguru S N，Banks S W，Gossett D R，et al.Antioxidant response to salt stress during fiber development in cotton ovules［J］.The Journal of Cotton Science，1999，3：11－18.

［13］ Tang W，HarrisL C，Outhavong V，et al.Antioxidants enhance in vitro plant regeneration by inhibitingthe accumulation of peroxidase inVirginia pine（Pinus virginianaMill）［J］.Plant Cell Rep，2004，22：871－877.