全自動生化分析儀實驗參數(shù)解析

張曉珍姜軍 張娣

(1.沈陽軍區(qū)興城療養(yǎng)院溫泉療養(yǎng)區(qū)，125100；2.遼寧省興城胃腸專科醫(yī)院檢驗科，125100)

全自動生化分析儀實驗參數(shù)解析

張曉珍1姜軍1張娣2

(1.沈陽軍區(qū)興城療養(yǎng)院溫泉療養(yǎng)區(qū)，125100；2.遼寧省興城胃腸專科醫(yī)院檢驗科，125100)

全自動生化分析儀(TAA)性能的高低、功能多少的不同，輸入的實驗參數(shù)也不盡相同。本文介紹了7種參數(shù)的設(shè)置方法及其意義，有利于儀器、試劑的正確使用，有助于正確分析和處理測定數(shù)據(jù)，正確設(shè)置參數(shù)是使用好儀器得出可靠結(jié)果的重要環(huán)節(jié)。

全自動生化分析儀；參數(shù)設(shè)置；質(zhì)量監(jiān)控；線性核查；前滯現(xiàn)象

1 試劑空白參數(shù)

設(shè)置試劑空白，目的是通過監(jiān)測試劑空白的吸光度，檢查試劑的質(zhì)量。一般來說吸光度上升的反應(yīng)，試劑空白吸光度越低越好。吸光度下降的反應(yīng)要求試劑空白吸光度不能低于一個底線，也就是說吸光度必須要求在某一數(shù)值以上。例如，在吸光度上升的反應(yīng)中，在特定波長下光徑1 cm比色杯、γ-GT、ALP、AMY、LDH、CK試劑空白吸光度應(yīng)≤0.6，CHO、TG、GLU的試劑空白吸光度≤0.8。有些項目在動力法測定時吸光度是下降的，即所謂負(fù)反應(yīng)，例如AST、ALT、UrEa、TCO2等項目的測定，試劑空白吸光度要求≥1.0。

上面列出的吸光度數(shù)值也并非一成不變，應(yīng)根據(jù)商家試劑盒說明書給出的試劑空白吸光度限值作為參數(shù)輸入儀器，在儀器運行過程中如發(fā)現(xiàn)試劑空白值超限，則儀器會報警或拒絕計算結(jié)果，此時應(yīng)查找原因或重新更換試劑。

2 校正參數(shù)

2.1 標(biāo)準(zhǔn)空白水平核查 全自動分析儀可將已知標(biāo)準(zhǔn)空白吸光度的允許波動范圍作為參數(shù)進(jìn)行輸入，進(jìn)行空白水平核查。

2.2 雙份標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)核查 將雙份標(biāo)準(zhǔn)測定的吸光度和雙份標(biāo)準(zhǔn)空白的吸光度取其差值(STD-SB)作為“重復(fù)界線”參數(shù)輸入，如果超出了“重復(fù)界線”值，應(yīng)考慮樣品加量是否準(zhǔn)確，反應(yīng)溫度是否達(dá)到要求，光電系統(tǒng)是否穩(wěn)定。

2.3 K值參數(shù)核查 K值核查是對標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的核查。在自動分析儀運算中K=STD÷Abs，儀器在測得標(biāo)準(zhǔn)物吸光度后會自動計算出K值(F值)。K值會被儀器自動儲存并用于以后樣品測定結(jié)果的計算。在正常情況下前后測得的K值應(yīng)允許在一定范圍內(nèi)波動，一般儀器可設(shè)為±2.0%。即參數(shù)輸入是0.02，如果超出2%則報警為“定標(biāo)失敗”或校正故障[1]。

3 樣品體積分?jǐn)?shù)參數(shù)

樣品體積分?jǐn)?shù)(SVF)是樣品體積與反應(yīng)液總體積的比值(SV/TV)。

酶活力測定中，樣品在總體積中的比例應(yīng)在10%以下，如在AST測定中，SVF在0.016 7～0.083 3范圍內(nèi)ΔA/ Δt呈線性變化。但當(dāng)SVF＞0.100以后就不呈線性了。IFCC選擇0.083 3，有的廠商試劑盒(Kit)選擇0.090 9。

ALP的測定在IFCC研究的數(shù)據(jù)表明，SVF應(yīng)在0.038 5～0.013 9范圍內(nèi)變動，當(dāng)SVF從0.038 5(SV/TV＝1/26)下降到0.019 6(SV/TV＝1/51)時，酶活性會輕度升高，即出現(xiàn)輕度稀釋效應(yīng)。如果進(jìn)一步降低SVF在0.019 6～0.013 9(1/72)之間，結(jié)果沒出現(xiàn)稀釋效應(yīng)。因而一些商家的試劑盒考慮到靈敏度信噪比而選擇了0.019 6為SVF。

在γ-GT測定中SVF在0.010～0.250之間沒有顯示出稀釋效應(yīng)，降低SVF有利于避免黃疸血清的干擾，并可提高線性范圍。IFCC推薦的SVF是0.019 1。

在CKNAC的測定中，稀釋效應(yīng)十分明顯，SVF微小變化會導(dǎo)致測定結(jié)果的明顯變化。因此SV、RV必須遵照商家試劑盒給出的數(shù)值嚴(yán)格掌握。

SVF是由多種因素決定的，SVF不能隨意改動。事實證明，SVF過高會增加血清內(nèi)源性干擾、特異性下降；SVF過低則會使反應(yīng)過程中產(chǎn)生的信號太小、信噪比增大，造成結(jié)果重復(fù)性下降。在儀器性能和方法學(xué)允許的條件下，在降低試劑消耗的同時要選擇最佳的SV/TV比值。

4 波長的選擇

全自動生化分析儀TAA采用的測定技術(shù)多是吸收光譜分析，分析儀配有6～8個常用干涉濾光片或更多，測定波波長原則上選擇待測物在該波長的光吸收最大；其吸收峰宜較寬而鈍；常見干擾物在該波長下的光吸收最小。另外，有些儀器濾光片數(shù)量受限，應(yīng)該以就近選擇為原則，如果儀器穩(wěn)定對測定結(jié)果影響不大。在酶類測定時要用消光系數(shù)計算酶活性，受波長影響較大，所以對波長的要求相對嚴(yán)格，有些項目需要做雙波長或多波長檢測，主波長是待測物光吸收最大，副波長的作用主要是排除測定過程中的干擾因素或提高測試過程中的靈敏度。波長測定可以免除試劑空白和樣品空白的設(shè)置。

5 反應(yīng)時間參數(shù)

5.1 延遲時間 延遲時間指試劑與樣品混合后到監(jiān)測開始之間的時間。延遲時間的選擇取決于被測物質(zhì)的濃度、反應(yīng)速度的快慢、酶促反應(yīng)的級數(shù)、樣品中干擾物所需要的時間等。如CHE活性高僅需20～30 s，LDH一級反應(yīng)需30～40 s，ALT需40～60 s，AST需60～75 s，CK需90～120 s等。

5.2 監(jiān)測時間 酶促反應(yīng)延遲期后，在過量底物的存在下，反應(yīng)速率加快并達(dá)到一個反應(yīng)速率穩(wěn)定的階段，即為線性反應(yīng)期，全自動生化分析儀的監(jiān)測時間即為此期。測酶的連續(xù)監(jiān)測法至少90～120 s或至少4個點(3個ΔA)才稱其為連續(xù)監(jiān)測[2]，但如果監(jiān)測時間太長容易導(dǎo)致發(fā)生底物耗盡，如果縮短監(jiān)測時間就減少了線性測定范圍，可測范圍變窄。所以分析反應(yīng)流程，合理設(shè)置延遲時間和監(jiān)測時間就顯得尤為重要。

6 線性與反應(yīng)限參數(shù)

6.1 線性核查 全自動生化分析儀能對反應(yīng)線性進(jìn)行實時監(jiān)測，如果在監(jiān)測時間(TRI)內(nèi)發(fā)現(xiàn)非線性結(jié)果，TAA會報警提示，防止因樣品、試劑及儀器各方面因素造成的錯誤結(jié)果混入正常報告中。此時操作者可調(diào)出實時反應(yīng)曲線，分析非線性(NL)產(chǎn)生的原因，必要時可通過修改參數(shù)得到線性結(jié)果。

不同的生化分析儀線性核查所依據(jù)的數(shù)學(xué)公式并非一樣，有的儀器把用最小二乘法得到的全過程曲線Abs-time分成二段，每段根據(jù)監(jiān)測時間可分成3～6個點，然后分別求出前段的Δt/min和后段的Δ1/min，以及全過程的Δ/min，然后再按下式計算和判斷：

一般線性誤差設(shè)為±(10%～15%)，如超過規(guī)定誤差即報警為非線性結(jié)果。對于非線性的計算，多數(shù)是設(shè)為±10%，最簡單的公式是將監(jiān)測時間TRI等分4段得4個ΔA/Δt，分別設(shè)為X1、X2、X3、X4，然后按下面的公式進(jìn)行計算：

此計算公式表明，非線性標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是±10%。

6.2 反應(yīng)限核查 在線性反應(yīng)區(qū)域被確定后，將測定范圍內(nèi)的Abs數(shù)據(jù)與反應(yīng)時間(Abs-time)作線性回歸分析，從中找到Abs-time回歸線，得到ΔA/min，即可進(jìn)行反應(yīng)限核查[3]。反應(yīng)限超限，一是指超出線性測量范圍；二是指在酶活性測定中“底物耗盡”。一般情況下在酶催化的反應(yīng)中底物都是處在過剩狀態(tài)，但日常工作中免不了會遇到超限標(biāo)本。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠，TAA都設(shè)法進(jìn)行反應(yīng)限核查。反應(yīng)限一般在試劑盒說明書中寫的是線性測量范圍，有的是以ΔA/min表示，二者可通過反應(yīng)限計算公式互相轉(zhuǎn)換。

7 前滯現(xiàn)象分析及樣本稀釋參數(shù)

7.1 前滯現(xiàn)象分析 抗原性物質(zhì)與對應(yīng)的特異性抗體可形成抗原(Ag)-抗體(Ab)復(fù)合物，這些免疫復(fù)合物可通過比濁的方法進(jìn)行測定。在比濁法中，我們常見的抗原物質(zhì)很多，如：血清蛋白、補(bǔ)體、免疫球蛋白、急性反應(yīng)蛋白、血凝蛋白及尿微量蛋白等等。在Ag-Ab結(jié)合的過程中，在Ab一定時，增加Ag的濃度可出現(xiàn)如下3種情況：①反應(yīng)初期，反應(yīng)向Ag-Ab復(fù)合物形成的方向進(jìn)行，此時反應(yīng)濁度增加。②繼續(xù)增加Ag濃度，反應(yīng)濁度不再增加，達(dá)到平衡狀態(tài)(平衡區(qū))。③再繼續(xù)增加Ag濃度，將導(dǎo)致濁度(沉淀)溶解，濁度反而下降(吸光度也隨之降低)。此稱為Ag過剩區(qū)。這種現(xiàn)象也稱為前滯現(xiàn)象。前滯現(xiàn)象是指在化學(xué)反應(yīng)中，隨著反應(yīng)時間的延長及反應(yīng)物濃度的作用，使生成物停止或不再增多，或出現(xiàn)逐漸減少現(xiàn)象[4]。反應(yīng)超限即是前滯現(xiàn)象的表現(xiàn)。

7.2 樣本稀釋參數(shù) 全自動生化分析儀在參數(shù)設(shè)置的時候，要把樣本是否稀釋以及樣本稀釋比例作為樣本稀釋參數(shù)輸入儀器中，一般情況下，樣品與稀釋液比例應(yīng)為1∶10，輸入稀釋參數(shù)的目的是為了避免樣本反應(yīng)超限和前滯現(xiàn)象的發(fā)生。

通過上述7個方面實驗參數(shù)的討論，可以看出參數(shù)的正確設(shè)置是保證儀器分析質(zhì)量的前提。全自動生化分析儀種類繁多，但其工作原理卻基本相同或相似，只有掌握其工作原理，才能對不同的實驗測試選擇正確的參數(shù)設(shè)置，發(fā)揮全自動生化分析儀準(zhǔn)確高效的服務(wù)品質(zhì)。

[1]韓志均，李樹中，田維發(fā)，等.臨床化學(xué)項目自動分析法[M].沈陽：遼寧科技出版社，1991：23-56.

[2]夢獻(xiàn)榮，丁書亞，甘來軍.自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置技巧[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2009，18(10)：136.

[3]葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜，等.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].3版.南京：東南大學(xué)出版社，2006：59-65.

[4]叢玉隆.檢驗醫(yī)學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：216-218.

1005-619X(2012)09-0814-02

2012-06-04)