高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（TJM～92株）免疫效果與安全性試驗報告

包新奇，陳昌海，程雷，高升，徐正軍，徐小艷， 劉耀興，李百忠，陳建英.3，張晨飛

（1.江蘇省動物疫病預防控制中心，江蘇南京 210036；2.江蘇省如皋市畜牧獸醫站，江蘇如皋 226572；3.拉薩市動物疫病預防控制中心，西藏拉薩 850000）

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（TJM～92株）免疫效果與安全性試驗報告

包新奇1，陳昌海1，程雷1，高升1，徐正軍1，徐小艷1， 劉耀興1，李百忠2，陳建英1.3，張晨飛1

（1.江蘇省動物疫病預防控制中心，江蘇南京 210036；2.江蘇省如皋市畜牧獸醫站，江蘇如皋 226572；3.拉薩市動物疫病預防控制中心，西藏拉薩 850000）

目前我國控制高致病性豬藍耳病主要采取以疫苗免疫為主的綜合性防控措施，并將高致病性豬藍耳病列為強制免疫的4個疫病之一。為了解高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（TJM-92株）免疫效果與安全性，我們開展了該活疫苗的有關試驗，現將試驗結果報告如下。

一、材料與方法

（一）試驗用疫苗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（TJM-92株），生產批號2010005，生產日期2010-02-06，由新疆天康畜牧生物技術有限公司提供。

（二）試驗用豬試驗在江蘇省如皋市某豬場進行，隨機選擇3～4周齡仔豬160頭。

（三） 試劑

1.豬藍耳病抗體檢測。豬藍耳病抗體檢測ELISA試劑盒，批號40959-4201，有效期2011.6.30，由美國IDEXX公司提供。

2.高致病性豬藍耳病病原檢測。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nsp2 1594～1680變異株）RTPCR檢測試劑盒，批號20100806P，由北京世紀元亨公司提供。

（四）試驗設計

1.疫苗免疫效果試驗。隨機選擇3～4周齡仔豬40頭，按使用說明書劑量，頸部肌肉注射30頭，1頭份/頭，耳標標號，同時設對照組10頭，不接種疫苗，耳標標號。免疫前采集試驗組豬血清20份，對照組豬血清6份，用于檢測高致病性豬藍耳病病原和抗體。免疫后14天、28天、2個月、3個月、4個月，分別采集試驗組20份豬血清和對照組6份豬血清，檢測高致病性豬藍耳病免疫抗體，進行免疫效果評價試驗。

2.疫苗安全性試驗。隨機選擇3～4周齡仔豬10頭，按使用說明書劑量的10倍量（10頭份/頭）頸部肌肉注射，耳標標號。免疫后觀察21 d，觀察內容包括全身皮膚、精神狀況、食欲、體溫及注射局部反應等，進行安全性試驗。

3.疫苗普免試驗。隨機選擇3～4周齡仔豬100頭，按使用說明書劑量，頸部肌肉注射，1頭份/頭，耳標標號。免疫后觀察21 d，觀察內容包括全身皮膚、精神狀況、食欲、體溫及注射局部反應等，進行普免試驗。

（五）試驗方法

1.豬藍耳病血清抗體檢測。采用豬藍耳病抗體檢測ELISA試劑盒檢測PRRS抗體，主要操作步驟與結果判定如下：

⑴ 取出抗原包被板，在記錄表上記錄樣本的位置。

⑵ 在C1、D1的 PRRS孔和C2、D2的NHC孔內分別加入 100μl 沒有稀釋的陰性對照。在 A1、B1的 PRRS孔和 A2，B2 的 NHC孔內分別加入100μl 沒有稀釋的陽性對照。

⑶ 在相鄰的 PRRS 和 NHC 孔內分別加入100μl 按1：40稀釋好的樣本。所有樣品均按此原則加 2孔。

⑷ 室溫下孵育30 min。

⑸ 吸取各孔的液體棄入廢液筒。用大約300μl 磷酸緩沖洗滌液洗滌板孔，重復 3～5 次。每次洗滌后應吸去孔內的液體。注意應避免包被板孔干燥。在最后一次洗滌液吸去后，將每塊板中殘留的洗滌液扣拍到吸水材料上。

圖1 接種疫苗后豬群體血清抗體轉陽情況

圖2 免疫后不同時間豬群抗體陽性率的變化情況

⑹ 每孔加入100μl 辣根過氧化物酶標記的抗豬抗體。

⑺ 室溫下孵育30 min。

⑻ 重復步驟“⑸”。

⑼ 每孔加入100μl TMB 底物液。

⑽ 室溫下孵育15 min。

⑾ 每孔加入100μl 終止液，使反應終止。

⑿ 測量并且記錄樣本和對照的 A(650），計算結果。

⒀ 結果判定：①如果 S/P 值低于0.4，樣品判定為 PRRS 抗體陰性；②如果 S/P 值大于或等于 0.4，樣品判定為 PRRS 抗體陽性。

2.高致病性豬藍耳病病原檢測。采用豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nep2 1594～1680變異株）RTPCR檢測試劑盒檢測，主要操作步驟與結果判定如下。

⑴ 樣品處理：每份樣品分別處理。

組織樣品：稱取組織樣品0.05 g研磨后加1.5 ml生理鹽水繼續研磨，轉至1.5 ml滅菌離心管中，8 000 rpm離心2 min，取上清100 ul于1.5 m滅菌離心管中。

全血樣品：待血凝后離心取血清100 ul，置1.5 ml滅菌離心管中。

陽性對照：取陽性對照100 ul，置1.5 ml 滅菌離心管中。

陰性對照：取陰性對照100 ul，置1.5 ml 滅菌離心管中。

⑵ 病毒RNA提取：取已處理的樣品及陰、陽性對照，分別加入裂解液600 ul，充分顛倒混勻，室溫靜置3～5 min。

將液體吸入吸附柱中，13 000 rpm離心30 s，棄去收集管中液體，套上收集管。向吸附柱中加入600 ul洗液，13 000 rpm離心30 s，棄去收集管中液體，套上收集管。

再次向吸附柱中加入600 ul洗液，13 000 rpm離心30 s，棄去收集管中液體，套上收集管。再空柱離心2 min。

將吸附柱移入新的1.5 ml離心管中，在膜中央加入洗脫液25 ul，室溫靜置1 min，13 000 rpm離心30s，棄去吸附柱，獲得總RNA備用。

⑶ RT～PCR操作程序

每 份 總 體 積20 uL， 含16.8 uL RT～PCR反 應 液，1.2 uL 酶混合液，2 uL 模板RNA。

在PCR擴增儀上進行以下程序：42℃ 45 min，94℃ 3 min；擴增條件為 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃延伸7 min。

⑷ 電泳：在電泳槽內放好梳子，倒入瓊脂糠凝膠，待凝固后將PCR產物10 ul點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110～120 V電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結果。

⑸ 結果判定：陽性對照出現278 bp擴增帶、陰性對照無帶出現時，實驗結果成立。被檢樣品出現278 bp擴增或200 bp擴增為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nsp21594～1680變異株）陽性，否則為陰性。

二、實驗結果

1.高致性豬藍耳病病原檢測結果。疫苗免疫前，試驗豬和對照豬經高致病性豬藍耳病病原RT～PCR檢測，均為陰性。

2.疫苗安全性試驗結果。按疫苗使用說明書劑量的10倍量接種后，觀察21 d，所有豬只精神、食欲、體溫均正常，注射局部無不良反應，表明該疫苗安全性好。

3.疫苗免疫試效果試驗。

⑴免疫后不同時間檢測豬群血清轉陽情況，見圖1。由圖1可知，活疫苗免疫后14天群體即有血清抗體轉陽豬只出現，隨后豬群血清抗體轉陽逐漸增多，S/P值也隨之增大；至90天時S/P值平均值達最大，120天時仍維持在2.15。

⑵免疫后不同時間豬群抗體陽性率的變化情況，見圖2。由圖2可知，豬群免疫后14天，群體抗體陽性率為50%，以后陽性率逐漸增高，到90天時達100%，120天時仍維持在100%的抗體陽性率，說明疫苗免疫效果好，抗體陽性率維持時間長。

三、討論

1.本試驗使用IDEXX公司生產的PRRS抗體檢測試劑盒檢測疫苗免疫后血清抗體水平，其S/P值的高低可以反映血清抗體的水平，進而反映疫苗免疫效果。由血清抗體檢測結果可知，該活疫苗免疫后14 d即可檢測出血清抗體轉陽，說明該疫苗免疫抗體產生快，而且隨后S/P值不斷增加，說明血清抗體濃度不斷增加，到90 d時，S/P值達2.31，這時抗體效價最高，至120天時，S/P值仍為2.15。說明高濃度血清抗體維持時間長，疫苗免疫效果好。

2.血清抗體陽性率是反應疫苗免疫后群體抗體狀態的一個重要數據，群體血清抗體陽性率高，維持時間越長，說明疫苗免疫效果越好，本次試驗結果同樣說明該疫苗免疫效果好。

3.疫苗的安全性試驗說明該疫苗對3～4周齡仔豬安全。

4.根據本次試驗結果，仔豬到育肥豬推薦的免疫程序如下：仔豬3～4周齡接種，1頭份/頭，至肥豬5個月出欄。

（略）