慢性腦缺血大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生及EGb761的影響

仲玉潔

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞突起包繞神經(jīng)元胞體及突起，構(gòu)成神經(jīng)元的微環(huán)境。它不僅支持、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元，更能促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)，提高神經(jīng)元活力［1］。但是當(dāng)慢性腦缺血(chronic cerebral ischemia，CCI))時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞過度反應(yīng)性增生，可產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性作用的細(xì)胞因子，并可通過刺激小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)和炎癥介質(zhì)而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用［2］。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生在一定程度上反映了腦缺血缺氧的程度。本試驗(yàn)通過對(duì)慢性腦缺血大鼠模型給予國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)含量的銀杏葉提取物EGb761進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)慢性腦缺血損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生的影響，為其在慢性腦缺血的預(yù)防和治療方面開辟新思路、提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 雄性SD大鼠30只，體重(220±30)g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成3組:A組為假手術(shù)組，B組為單純?nèi)毖M，C組為EGb761干預(yù)組，每組10只。

1.2 藥物與試劑 EGb761(達(dá)納康，按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物要求選取，內(nèi)含24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內(nèi)酯)，40 mg/粒，由法國(guó)博福-益普生制藥工業(yè)公司生產(chǎn);GFAP抗體(膠質(zhì)原纖維酸性蛋白抗體)，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CCI模型鼠的復(fù)制 參考Wakita等［3］方法制備動(dòng)物模型。10%水合氯醛(0.3 mg/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉后，頸部備皮、消毒，頸正中切開皮膚，切口約1.5～2.0 cm，鈍性分離筋膜、胸骨舌骨肌，分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，每側(cè)用雙線分別在近心端和遠(yuǎn)心端結(jié)扎，然后在兩結(jié)扎處之間剪斷頸總動(dòng)脈制備出單純?nèi)毖M和干預(yù)組模型，假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎，縫合切口，對(duì)皮并消毒，放回原環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.3.2 給藥方法 將達(dá)納康研成粉末狀，用蒸餾水溶解并混勻，術(shù)后24 h按照0.5 m l/100 g予灌胃，單純?nèi)毖M給予等量蒸餾水灌胃，各組灌胃均為1次/d，持續(xù)12周。

1.3.3 標(biāo)本的收集與處理 大鼠經(jīng)麻醉后，常規(guī)生理鹽水及多聚甲醛灌注、固定，斷頭取腦，制作腦部冠狀石蠟切片(厚度4μm)，采用免疫組化染色方法檢測(cè)腦組織皮層、胼胝體及海馬GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的情況。

2 結(jié)果

大鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的變化情況:各組均取皮層、胼胝體、海馬處進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。單純?nèi)毖MGFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于假手術(shù)組和EGb761組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠皮層、胼胝體、海馬GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況(±s，n=10，個(gè)/400 倍高倍視野)

表1 各組大鼠皮層、胼胝體、海馬GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況(±s，n=10，個(gè)/400 倍高倍視野)

注:◆干預(yù)組與單純?nèi)毖M比較P＜0.01，*單純?nèi)毖M與假手術(shù)組比較P＜0.01

組別 皮層 胼胝體 海馬假手術(shù)組12.9±1.66 17.0±1.49 10.5±2.55單純?nèi)毖M 28.2±1.87* 28.5±1.58* 24.3±2.46*干預(yù)組 19.4±1.43◆ 22.0±1.49◆ 16.6±1.51◆

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)在數(shù)目占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的一類膠質(zhì)細(xì)胞，被認(rèn)為在神經(jīng)元的整個(gè)發(fā)育過程中起重要作用［4］，它參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元功能的調(diào)節(jié)，在維持神經(jīng)元的生存微環(huán)境中起著重要的作用。缺血性腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生并產(chǎn)生許多生物活性物質(zhì)，對(duì)缺血損傷神經(jīng)元具有保護(hù)作用;而星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性腦損傷后過度的增生并產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)，包括谷氨酸、鉀、乳酸、花生四烯酸、NO和Ca2+流量變化等，反過來(lái)既可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷和功能障礙，又可作為機(jī)械屏障影響髓鞘和軸索的再生，從而影響周圍神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù)，所有這些因素則可影響神經(jīng)元存活［5］。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生在一定程度上反映了腦缺血缺氧的程度。我們采用免疫組化GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞的方法觀察各組大鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，單純?nèi)毖M大鼠皮層、海馬、胼胝體內(nèi)的GFAP表達(dá)較假手術(shù)組和干預(yù)組明顯增多，提示慢性腦缺血損傷后，腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性的過度增生。

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)EGb761，含24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內(nèi)酯等多種活性物質(zhì)，可協(xié)同作用于有關(guān)氧化應(yīng)激、血液循環(huán)、神經(jīng)遞質(zhì)和炎癥反應(yīng)等不同的病理過程。現(xiàn)已證實(shí):EGb761中銀杏黃酮為自由基清除劑，銀杏內(nèi)酯為特異性PAF受體阻滯藥，對(duì)缺血時(shí)的神經(jīng)有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用EGb761對(duì)慢性腦缺血大鼠灌胃治療，觀察大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGb761干預(yù)組反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的情況較單純?nèi)毖M明顯改善，提示EGb761能抑制腦缺血時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度表達(dá)，這可能與EGb761能夠針對(duì)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的多種損傷機(jī)制，如氧自由基、Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性作用和生物膜損傷等進(jìn)行干預(yù)有關(guān)。盡管EGb761確實(shí)有神經(jīng)保護(hù)作用，但其抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增生的確切機(jī)制仍需深入研究。

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［4］莫永炎，姜勇，陳瑗，等.腦星形膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能研究進(jìn)展.生理科學(xué)進(jìn)展，2002，33(1):71-74.

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