甘草次酸衍生物TY501對小鼠免疫系統(tǒng)的影響

靳如芳 郭 舜 張金曉 邸志權(quán) 田義紅

1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.天津市新藥安全評價中心，天津 300301

甘草次酸是傳統(tǒng)中藥甘草發(fā)揮抗炎作用的主要藥效成分。20 世紀50年代開始，中外許多學者研究證明甘草次酸具有抗炎作用，對多種急、慢性炎癥均有明顯的抑制作用[1-2]。甘草次酸類藥物對機體免疫功能影響復雜。Yoshikama等[3]研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素可選擇性地增強輔助性T淋巴細胞的增殖能力和活性，使CD3+CD4+細胞增加，CD3+CD8+細胞減少。甘草酸類具有非特異性免疫調(diào)節(jié)作用，主要是增強細胞免疫作用，可增強巨噬細胞（Mφ）的吞噬功能，消除抑制性Mφ的抑制活性，還可選擇性地增強輔助性T淋巴細胞的增殖能力和活性[4-5]。由天津藥物研究院合成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的TY501（11-脫氧甘草次酸-30-酰胺衍生物）為甘草次酸衍生物，具有甾體類似結(jié)構(gòu)，經(jīng)過前期一系列動物體內(nèi)藥效學實驗，發(fā)現(xiàn)其具有類似甾體類藥物（如潑尼松龍）的抗炎作用[6]；長期毒性研究未發(fā)現(xiàn)其有甾體類藥物（如潑尼松龍）的免疫抑制作用。現(xiàn)通過小鼠灌胃給藥，研究TY501 對小鼠體重和中樞免疫器官胸腺、脾臟的影響，采用ADVIA 2120 血液分析儀測定小鼠外周血白細胞數(shù)及淋巴細胞、嗜中性粒細胞數(shù)量及比例，采用BD FACSAriaTMⅡ流式細胞儀測定藥物對小鼠外周血中淋巴細胞亞型的影響，探究并比較TY501 與潑尼松龍對免疫系統(tǒng)影響的差異。

1 儀器與試藥

1.1 試驗藥物

TY501：白色粉末，含量為97.8%，批號為20100512，天津藥物研究院化學制藥研究部提供。試驗前用精制玉米油配制成適當濃度，供動物灌胃給藥。

潑尼松龍：白色結(jié)晶粉末，含量98.2%，批號為PL100107，天津天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。試驗前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成適當濃度，供動物灌胃給藥。

1.2 動物

ICR小鼠，雌雄各半，實驗開始時小鼠體重均為18～22 g。北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2006-0009。飼料為鼠專用全價營養(yǎng)塊料（天津市華榮實驗動物科技有限公司生產(chǎn)）。動物均飼養(yǎng)在有中央空調(diào)的觀察室，飲用動物飲用水。

1.3 主要試劑及儀器

精制玉米油（華北制藥康欣有限公司生產(chǎn)，規(guī)格5 L/桶，批號：081203），羧甲基纖維素鈉300～800 M[國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，規(guī)格化學純（CP）500 g，批號：20081015]，染色檢測試劑 （PerCP Hamster Anti-Mouse CD3e；FITC Rat Anti-Mouse CD4；PE Rat Anti-Mouse CD8a；PerCP Hamster IgG1，k Isotype；FITC Rat IgG2，k Isotype Control；PE Rat IgG2a，k Isotype Control；PE Mouse Anti-Mouse NK1.1；FITC Rat Anti-Mouse CD19；PE Mouse IgG2a，k Isotype Control。所有染色試劑均為BD Pharmingen公司提供流式專用試劑），流式細胞儀專用鞘液 （BD FACSFlow鞘液，規(guī)格：20 L，批號：1015300043）。

電子天平[梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司，PL203]，電子天平[（美國雙杰兄弟（集團）有限公司常熟雙杰測試儀器廠，T 2000）]，血液分析儀（Siemens Healthcare Diagnostics Inc，ADVIA 2120），流式細胞儀（bdbiosciences.com，BD FACSAriaTMⅡ）

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗方法

實驗設(shè)5組，每組10只動物，雌雄各半。分別為正常對照組、潑尼松龍組（15.0 mg/kg）、TY501 低劑量組（6.7 mg/kg）、T501 中劑量組（20.0 mg/kg）、TY501 高劑量組（60.0 mg/kg）。正常對照組給予動物飲用水；潑尼松龍組灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉配制的濃度為0.75 mg/ml的混懸液；TY501低、中、高劑量組分別灌胃給予精制玉米油配制的濃度為0.33、1.00、3.00 mg/mL的混懸液。各組分別連續(xù)灌服相應的藥物23 d， 給藥體積均為20 mL/kg。 于給藥后第 0、7、14、21天分別稱量動物體重；末次給藥24 h后，用毛細管從眼眶靜脈叢采血，0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用ADVIA 2120 血液分析儀測定小鼠外周血白細胞數(shù)及淋巴細胞、嗜中性粒細胞數(shù)量及比例，采用流式細胞儀測定外周血中淋巴細胞亞型 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NK1.1 的比例；通過白細胞分類中淋巴細胞數(shù)量和淋巴細胞亞型的比例計算外周血中各淋巴細胞亞型的數(shù)量；稱量動物體重，剖殺并稱取脾臟、胸腺，計算臟器指數(shù)。

2.2 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 11.5 對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.3 結(jié)果

2.3.1 對小鼠體重、胸腺、脾臟的影響 結(jié)果顯示，與正常對照組比較，給藥第7 天至實驗結(jié)束時，潑尼松龍組動物體重明顯降低（P＜0.01 或P＜0.001）；TY501 各劑量對動物體重未見明顯的變化。與正常對照組比較，潑尼松龍組小鼠脾臟、胸腺濕重及相應系數(shù)明顯降低（P＜0.001），說明潑尼松龍對小鼠中樞免疫器官具有明顯的抑制作用；TY501 各劑量組小鼠脾臟、胸腺濕重及相應系數(shù)未見明顯的變化，提示TY501 各劑量組未對小鼠中樞免疫器官起到明顯的抑制作用。見表1、2。

表1 不同給藥組對小鼠體重的影響（±s，g）

表1 不同給藥組對小鼠體重的影響（±s，g）

注：與正常對照組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別只數(shù) 給藥劑量（mg/kg） 第0 天 第7 天 第14 天 第21 天正常對照組潑尼松龍組TY501 低劑量組TY501 中劑量組TY501 高劑量組10 10 10 10 10-15.0 6.7 20.0 60.0 21.4 ±1.0 21.3 ±0.9 21.1 ±0.8 21.0 ±0.9 21.0 ±1.0 24.8 ±3.1 21.6 ±2.4**24.8 ±2.8 24.8 ±3.6 24.7 ±3.1 26.8 ±3.6 21.2 ±1.6***26.3 ±3.6 27.4 ±3.8 26.7 ±4.2 27.1 ±5.0 22.6 ±2.8**27.7 ±3.8 28.3 ±3.9 28.1 ±4.3

2.3.2 對小鼠外周血白細胞數(shù)及淋巴細胞、嗜中性粒細胞數(shù)的影響 與正常對照組比較，潑尼松龍組白細胞總數(shù)未見明顯變化，淋巴細胞數(shù)明顯降低（P＜0.01），僅比正常對照組的50%略高，這與表2 得到的脾臟、胸腺重量及系數(shù)降低相一致；嗜中性粒細胞數(shù)明顯升高（P＜0.001），可能原因為動物由于免疫力下降存在隱性感染所致。TY501 低、中劑量組對小鼠白細胞總數(shù)、淋巴細胞數(shù)、嗜中性粒細胞數(shù)均未見明顯變化，未出現(xiàn)與潑尼松龍組相類似的使小鼠淋巴細胞數(shù)顯著下降的影響；TY501 高劑量組白細胞數(shù)及嗜中性粒細胞數(shù)明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），可能是TY501 毒性反應的結(jié)果。結(jié)果見表3。

表2 不同給藥組對小鼠脾臟、胸腺重量及系數(shù)的影響（±s）

表2 不同給藥組對小鼠脾臟、胸腺重量及系數(shù)的影響（±s）

注：與正常對照組比較，***P＜0.001

組別只數(shù) 給藥劑量（mg/kg） 脾濕重（g） 脾系數(shù)（g/g） 胸腺濕重（g） 胸腺系數(shù)（g/g）正常對照組潑尼松龍組TY501 低劑量組TY501 中劑量組TY501 高劑量組10 10 10 10 10-15.0 6.7 20.0 60.0 0.144 ±0.030 0.077 ±0.018***0.148 ±0.042 0.183 ±0.031 0.156 ±0.038 0.005 5 ±0.001 5 0.003 4 ±0.000 7***0.006 0 ±0.002 4 0.006 6 ±0.001 6 0.005 9 ±0.001 7 0.046 ±0.010 0.012 ±0.005***0.051 ±0.015 0.051 ±0.015 0.058 ±0.018 0.001 8 ±0.000 6 0.000 5 ±0.000 2***0.002 0 ±0.000 7 0.001 9 ±0.000 7 0.001 7 ±0.008 8

2.3.3 對小鼠外周血淋巴細胞亞型的影響 與正常對照組比較，潑尼松龍組給藥后CD3+T總淋巴細胞和CD3+CD8+T淋巴細胞比例明顯升高（P＜0.01 或P＜0.001），CD4+/CD8+比值顯著降低（P＜0.001），但結(jié)合給藥后淋巴細胞絕對數(shù)量計算T淋巴細胞及其各亞型的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，外周血中T總淋巴細胞絕對數(shù)量不僅沒有升高，反而降低，各亞型T淋巴細胞中又以CD3+CD4+數(shù)量減少為主，CD3+CD8+數(shù)量沒有明顯變化，CD3-CD19+淋巴細胞比例與數(shù)量均顯著降低（P＜0.001）（表5），說明潑尼松龍對小鼠細胞免疫和體液免疫均有明顯的抑制作用。與正常對照組比較，TY501 中、高劑量組給藥后CD3-CD19+亞型淋巴細胞比例顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），結(jié)合給藥后淋巴細胞絕對數(shù)量計算發(fā)現(xiàn)各組B淋巴細胞、NK細胞數(shù)量增多，說明TY501 有增強體液免疫和非特異性免疫功能的趨勢；由于CD3-CD19+亞型淋巴細胞比例顯著升高致使CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T 淋巴細胞比例均有所降低（P ＜ 0.05或P＜0.01），CD4+/CD8+比值基本未有變化，結(jié)合給藥后淋巴細胞絕對數(shù)量計算T淋巴細胞的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，TY501 各劑量組給藥后T淋巴細胞數(shù)均沒有降低，反而有所升高， 但僅TY501 低劑量組和TY501 高劑量組的NK1.1 值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 結(jié)果見表4、5。

表3 不同給藥組對小鼠外周血白細胞、淋巴細胞、嗜中性粒細胞數(shù)量的影響（±s，×109/L）

表3 不同給藥組對小鼠外周血白細胞、淋巴細胞、嗜中性粒細胞數(shù)量的影響（±s，×109/L）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別只數(shù) 給藥劑量（mg/kg） 白細胞 淋巴細胞 嗜中性粒細胞正常對照組潑尼松龍組TY501 低劑量組TY501 中劑量組TY501 高劑量組10 10 10 10 10-15.0 6.7 20.0 60.0 4.46 ±1.91 4.65 ±1.60 5.79 ±1.50 4.97 ±1.57 7.11 ±2.64*2.94 ±1.45 1.62 ±0.38**3.89 ±1.34 3.50 ±1.34 4.51 ±2.77 0.92 ±0.44 2.46 ±1.19***1.32 ±0.78 0.98 ±0.37 2.02 ±1.14**

3 討論

本研究結(jié)果表明，潑尼松龍持續(xù)灌胃給藥21 d，對動物中樞免疫器官的發(fā)育生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用，胸腺、脾萎縮，重量及指數(shù)顯著降低，外周血中淋巴細胞數(shù)量減少，CD4+/CD8+比例顯著降低（P＜0.001）；CD3+CD8+亞型 T 細胞按其生物學功能又可分為抑制性細胞Ts或細胞毒性T細胞（CTL），其中Ts細胞可通過自身及分泌抑制因子在免疫反應中起負向調(diào)節(jié)作用，抑制B細胞和CD3+CD4+細胞的功能，從而抑制抗體形成及細胞免疫反應[7]。結(jié)合血液學測定儀和流式細胞儀測得的各亞型淋巴細胞的比例及計算各亞型淋巴細胞的數(shù)量結(jié)果顯示，CD3+CD4+亞型淋巴細胞數(shù)量明顯降低（P＜0.05），B 淋巴細胞數(shù)量顯著降低（P＜0.001），說明潑尼松龍對動物機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，尤其對體液免疫功能抑制作用更為顯著，這與有關(guān)文獻的報道相一致[8]。糖皮質(zhì)激素是強效的抗炎藥物，臨床上廣泛應用，但由于其免疫抑制作用限制了它的臨床應用。開發(fā)新型糖皮質(zhì)激素類藥物，在保留其抗炎活性的同時減少副作用尤為迫切，是近幾年來國內(nèi)外藥物學家一直致力于研究的熱點領(lǐng)域[9]。

表4 不同給藥組對小鼠外周血中各淋巴細胞亞型比例的影響（±s，%）

表4 不同給藥組對小鼠外周血中各淋巴細胞亞型比例的影響（±s，%）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別只數(shù) 給藥劑量（mg/kg） CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD4+/CD8+ CD3-CD19+ NK1.1正常對照組潑尼松龍組TY501 低劑量組TY501 中劑量組TY501 高劑量組10 10 10 10 10-15.0 6.7 20.0 60.0 52.3 ±5.9 61.9 ±8.6**47.3 ±11.1 44.9 ±7.5**45.9 ±6.9*40.5 ±4.9 39.4 ±6.9 35.4 ±8.0 33.8 ±5.4**31.3 ±10.3*9.1 ±1.9 18.3 ±4.9***7.9 ±2.4 7.7 ±2.3 7.2 ±1.4**4.6 ±1.0 2.3 ±0.6***4.3 ±1.5 4.7 ±1.2 4.7 ±1.0 29.2 ±5.7 8.3 ±3.8***32.3 ±13.1 38.3 ±7.7**35.3 ±6.1*3.9 ±1.1 7.7 ±3.3**4.5 ±2.3 4.1 ±1.4 5.3 ±1.9*

表5 不同給藥組對小鼠外周血中各淋巴細胞亞型數(shù)量的影響（±s，×109/L）

表5 不同給藥組對小鼠外周血中各淋巴細胞亞型數(shù)量的影響（±s，×109/L）

注：與正常對照組比較：*P＜0.05，***P＜0.001

組別只數(shù) 給藥劑量（mg/kg） CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3-CD19+ NK1.1正常對照組潑尼松龍組TY501 低劑量組TY501 中劑量組TY501 高劑量組10 10 10 10 10-15.0 6.7 20.0 60.0 1.57 ±0.84 1.01 ±0.30*1.84 ±0.64 1.81 ±0.64 2.14 ±1.29 1.22 ±0.67 0.64 ±0.20*1.30 ±0.59 1.36 ±0.50 1.61 ±0.99 0.27 ±0.13 0.30 ±0.12 0.30 ±0.15 0.31 ±0.12 0.37 ±0.26 0.83 ±0.47 0.12 ±0.05***1.33 ±0.63 1.54 ±0.57 1.43 ±0.90 0.11 ±0.07 0.13 ±0.07 0.21 ±0.08*0.18 ±0.10 0.18 ±0.07*

TY501 持續(xù)灌胃給藥21 d，對小鼠中樞免疫器官、外周血中淋巴細胞數(shù)量及比例、淋巴細胞亞型等均未產(chǎn)生抑制作用。甘草酸和甘草次酸是甘草中含量最高的苷類化合物，也是甘草的主要甜味成分[10]。TY501 為甘草次酸衍生物，具有甾體類似結(jié)構(gòu)，動物實驗表明劑量為6.0 mg/kg時TY501 對冰醋酸致炎性滲出、角叉菜膠性足腫等小鼠急性炎癥具有最佳抗炎作用；在0.33 mg/kg時多次給藥對慢性炎癥模型大鼠棉球肉芽腫即有顯著的抑制作用，其抗炎作用與潑尼松龍相當（本課題組藥效學實驗尚未發(fā)表資料）。與甾體類藥物（潑尼松龍）相比，TY501 在保留了相當強的抗炎活性的同時，對小鼠免疫系統(tǒng)未發(fā)現(xiàn)明顯的抑制作用，使其有望進一步被開發(fā)成為有鮮明特色的抗炎藥物。

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