北柴胡幼根、子葉和下胚軸組織培養研究

徐麗霞

（山西藥科職業學院中藥系，山西太原030031）

北柴胡為傘型科多年生草本植物，主要以根入藥，具有和解退熱、舒肝解郁、升舉陽氣之功能。且柴胡為四季常用藥，在中成藥片劑、針劑、口服液等生產領域應用廣泛，需求量大[1]。然而，柴胡的野生資源逐年減少，人工種植存在種子發芽率低，栽培技術難度大等問題[2]。因而，應用組織培養技術進行優質柴胡植株培育并批量生產和供應市場是目前亟待解決的問題。

近年來，柴胡組織細胞培養方面已有一些研究[3-8]，羅玉[9]曾報道三島柴胡下胚軸離體培養的全息現象，張和禹等[10-11]對桑下胚軸、李永輝等[12]對黃瓜子葉和下胚軸、郟艷紅等[13]對番茄的子葉和下胚軸進行了組織培養。但關于北柴胡幼根、子葉和下胚軸系統的組織培養技術還未見報道。

本試驗在柴胡化學成分分析的基礎上選擇有效成分含量高的北柴胡種子，通過種子萌發得到幼苗，再利用幼根、子葉和下胚軸組織培養，旨在為柴胡優良品種的大規模繁殖提供技術數據。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗用北柴胡種子取自陵川縣農業開發區。

1.2 方法

1.2.1 北柴胡種子的萌發 選擇籽粒飽滿的北柴胡種子500粒，分成5份，每份100粒。采用1.0%高錳酸鉀浸種1 d，取出用清水洗凈，均勻播種于溫室育苗盆中，于20℃進行恒溫暗培養，30 d后得到柴胡幼苗。

1.2.2 北柴胡愈傷組織的誘導 取北柴胡幼苗用75%的酒精浸泡30 s，然后用0.1%HgCl2水溶液處理8～10 min，無菌水沖洗3～5次。將消毒后的苗分成幼根、下胚軸和子葉3段，分別切成1 cm小段接種于不同激素配比的MS或B5基本培養上，培養基pH值為6.0～6.5（表1）。在26～28℃條件下暗培養，每30 d繼代一次，統計愈傷組織誘導率，記錄愈傷組織的顏色、質地及生長狀況。最后，篩選出適宜的愈傷組織誘導培養基。

1.2.3 北柴胡不定芽的分化 分別將幼根、下胚軸和子葉的愈傷組織由三角瓶中取出，用解剖刀切成小塊，用無菌水洗凈瓊脂并接入附加不同濃度6-BA，NAA，和CH（水解酪蛋白）的MS或B5基本培養基上（表2）。每天光照12 h，光強度為2 000 lx，培養溫度26～28℃，40 d后進行統計。

1.2.4 北柴胡生根培養 將5 cm左右的叢生苗切成單苗轉至生根培養基1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L上，進行生根培養。每日光照12 h，光照強度為2 000 lx，培養溫度26～28℃。

2 結果與分析

2.1 不同培養基、外源激素配比對北柴胡幼根、下胚軸和子葉愈傷組織誘導的影響

培養8 d，下胚軸較幼根和子葉先開始形成愈傷組織。培養12d，幼根和子葉的切口處開始膨大。培養30 d，幼根、下胚軸和子葉形成愈傷組織。

從整體上看，MS培養基誘導愈傷組織的效果優于B5培養基，0.1 mg/L KT的誘導愈傷組織效果優于0.5 mg/LKT。2，4-D是柴胡愈傷組織誘導的主要激素，幼根和下胚軸是愈傷組織誘導的最佳材料。在MS＋2，4-D 1.0 mg/L＋KT 0.1 mg/L的培養基上，幼根和下胚軸愈傷組織誘導率均達100%，愈傷組織顏色為淡黃綠色，質地較硬，生長狀態良好；子葉愈傷組織誘導率最高（92%），愈傷組織顏色較黃，質地疏松，生長狀態良好（表1）。

表1 不同培養基、外源激素對北柴胡幼根、下胚軸和子葉愈傷組織誘導率的影響 %

2.2 不同培養基、外源激素配比對北柴胡愈傷組織誘導不定芽的影響

與幼根和子葉愈傷組織相比，下胚軸愈傷組織的分化能力最強，在分化培養基中培養30 d左右，愈傷組織塊上開始分化芽，且分化芽的數量逐漸增多；培養到40 d時，分化出芽的愈傷組織開始有少量根的分化，分化率最高可達98%。葉片愈傷組織在培養過程中有少部分褐化死亡，大部分繼續分裂增殖，但分化能力較下胚軸愈傷組織弱，分化率最高為66%；幼根愈傷組織分化能力最差，分化率最高僅為20%。

從表2可以看出，在B5培養基中加入一定量的6-BA，NAA和CH有利于柴胡幼根、下胚軸和子葉愈傷組織分化芽，6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.03 mg/L＋CH 250 mg/L的培養基，幼根、下胚軸和子葉形成的愈傷組織分化率最高。

表2 不同培養基、外源激素配比對北柴胡愈傷組織不定芽誘導率的影響 %

2.3 生根、煉苗與移栽

將5 cm左右的柴胡無根苗移入生根培養基1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L上，7 d后即形成不定根，不定根的誘導率為100%。當試管苗長至10 cm、有5～6條粗根時，擰開瓶蓋，用封口膜封上，在封口膜上扎少許小孔，7 d后，撤去封口膜，再培養3 d，轉入蛭石中煉苗7 d。以上過程均在培養室內進行，之后即可移栽入大田。

3 討論

由北柴胡外植體誘導形成愈傷組織及愈傷組織分化誘導不定芽的研究已有報道[7]。但大田采集外植體受到采集時間和種植地的限制：過了適宜采集期，外植體培養的愈傷組織質量不佳，分化能力差；種植地遠，采集材料消耗時間長，途中保存不當會造成材料萎蔫，分化能力下降。筆者在實驗室探索北柴胡種子發芽的適宜條件，提高了北柴胡種子發芽率，不受季節和柴胡種植地的影響，在溫室中得到柴胡幼苗，進行組織培養研究。同時，下胚軸和子葉的愈傷組織分化能力也非常強，大大提高了北柴胡組織培養的效率。

本試驗中由下胚軸形成的愈傷組織質地軟硬適中，分化率最高；而由幼根形成的愈傷組織分化率最差；由子葉形成的愈傷組織分化率居中。說明下胚軸是北柴胡由愈傷組織分化形成試管苗的最好材料。

試驗結果表明，愈傷組織誘導的最適基本培養基是MS培養基，而芽分化的最適基本培養基是B5培養基。

［1］姜德明，皋學宣.三島柴胡的開發前景及其優化栽培[J].現代農業，1995，3（2）：14.

［2］丁志勉，張旭.柴胡生物學研究進展[J].中國野生植物資源，2005，24（2）：11-13.

［3］Hiroshi Kohda，劉春華.柴胡芽尖的快速繁殖[J].國外特種經濟動植物，1992，44（1）：50-51.

［4］郝建平，周小梅，李寶平，等.柴胡固定化細胞培養[J].山西大學學報，1995，18（2）：190-193.

［5］周小梅，郝建平，張江濤，等.柴胡細胞懸浮培養[J].山西大學學報：自然科學版，1996，19（2）：191-194.

［6］郝建平，徐笑飛，楊東方，等.北柴胡快速繁殖及種子萌發條件研究[J].中草藥，2008，39（5）：752-756.

［7］郝建平，徐麗霞，楊東方.北柴胡愈傷組織誘導、分化及不定芽增殖條件研究[J].中草藥，2008，39（8）：1234-1238.

［8］楊東方，郝建平.北柴胡愈傷組織及不定根誘導研究[J].山西大學學報：自然科學版，2012，35（1）：140-144.

［9］羅玉.三島柴胡下胚軸離體培養的全息現象 [J].江西科學，1996，14（4）：218-222.

［10］張和禹，李東升，林青松.桑下胚軸愈傷組織誘導分化的研究[J].安徽農業科學，2O03，31（5）：776-777.

［11］夏時云，周祥明，付任勝.合歡植株再生體系快速建立技術的初步研究[J].天津農業科學，2008，14（5）：1-3.

［12］李永輝，白遠國，鄧紅云.CPPU對津春4號黃瓜子葉和下胚軸組織培養的研究[J].內蒙古農業科技，2007（4）：46-48.

［13］郟艷紅，王姝，劉仲齊.番茄下胚軸和子葉組織培養及植株再生的研究[J].天津農業科學，2012，18（1）:16-18.