干細胞因子及受體c－kit對A375細胞增殖和凋亡影響的體外研究

吳冬梅，岑 瑛

干細胞因子及受體c－kit對A375細胞增殖和凋亡影響的體外研究

吳冬梅，岑 瑛

目的 利用基因工程方法建立穩定表達干細胞因子受體(SCF/c-kit)的惡性黑素瘤A375細胞株，再給予外源性SCF/c-kit，觀察其對A375細胞增殖、凋亡的影響。方法 通過脂質體轉染技術構建穩定表達c-kit的黑素瘤細胞株（hc-kit/A375），給予A375細胞和hc-kit/A375細胞外源性SCF，將所有的細胞分為A375組、A375-SCF組、hc-kit/A375組和hc-kit/A375-SCF組。應用MTT法及流式細胞儀分析細胞的增殖和凋亡，并應用酶聯免疫吸附法（ELISA）和免疫組化方法檢測腫瘤細胞血管內皮生長因子(VEGF)，基質金屬蛋白酶(MMP)-9及腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達。結果 ①通過脂質體介導能將c-kit-pcDNA3.1 neo重組質粒成功轉染入黑素瘤細胞，建立穩定表達c-kit的黑素瘤細胞株hckit/A375，hc-kit/A375細胞中c-kit表達明顯增加。②給予外源性SCF后，細胞的生長受到抑制，以培養后第5天尤為顯著；細胞的凋亡率明顯增加，S期比例降低，且hc-kit/A375-SCF組尤明顯。③轉染后細胞及加入SCF干預組VEGF、MMP-9分泌減少，而TNF-α的分泌增加。結論 通過脂質體轉染和G418篩選成功構建穩定表達c-kit的A375細胞株；通過增加A375細胞中SCF/c-kit的表達能改變腫瘤細胞對VEGF、MMP-9、TNF-α的分泌，抑制腫瘤細胞的增殖，促進其凋亡。

黑素瘤，轉移性；干細胞因子；受體，干細胞因子；穩定轉染；A375細胞

[J Pract Dermatol, 2012, 5(4):193-198]

近年來，許多研究發現黑素瘤的發生、發展及轉移與多種分子相關，如p53，bcl-2，Fas/Fasl，血管內皮生長因子（VEGF），基質金屬蛋白酶（MMP）-9，干細胞因子受體/c-kit（SCF/c-kit）等。干細胞因子(stem cell factor，SCF)、肥大細胞生長因子 (mast cell growth factor，MGF)等，是1990年以來發現的一種重要的造血生長因子，主要由骨髓基質細胞 (包括脂肪細胞、成纖維細胞和內皮細胞)產生[1-3]。SCF通過與其受體的相互作用發揮其生物學活性。干細胞因子受體即c-kit，屬于3型受體酪氨酸激酶亞家族，c-kit蛋白相對分子質量為 145 000，又稱CD117。SCF/c-kit信號通路在黑素瘤中起著重要作用，SCF通過與其配體c-kit的相互作用，對黑素細胞的存活、分化、增殖和移行等方面起調節作用。

本研究利用基因工程的方法建立穩定表達c-kit的惡性黑素瘤細胞A375細胞株，然后給予外源性SCF，觀察其對腫瘤細胞生物活性的影響，從而為惡性黑素瘤的臨床治療提供一個新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

人黑素瘤細胞系細胞A375，由四川大學華西醫院移植免疫實驗室提供。A375細胞低表達c-kit；重組質粒c-kit-WT pcDAN3.1 neo（ATCC公司，美國）；脂質體lipofectine2000（Invitrogen公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞系及其培養 人黑素瘤細胞系細胞A375在含10%(體積分數)小牛血清的RPMI 1640培養基于體積分數為5%的CO2、37 ℃條件下培養。

1.2.2 c-kit質粒的提取及構建穩定表達c-kit的A375細胞株 將重組質粒c-kit-WT pcDAN3.1 neo進行擴增，提取質粒，用XhoⅠ及Bam H1限制性內切酶進行酶切鑒定后，用lipofectine2000脂質體轉染方法將c-kit轉染A375細胞，并通過G418進行抗性篩選陽性克隆。采用有限稀釋法獲得穩定表達c-kit的A375細胞，并通過RT-PCR和流式細胞儀檢測轉染后A375細胞中c-kit的表達。

1.2.3 細胞分組 本實驗將細胞分為4組：A375組(A組)為標準A375細胞；A375-SCF組(AS組)為標準A375細胞+10 ng/ml SCF；hc-kit/A375組(H組)為穩定轉染hc-kit的A375細胞；hc-kit/A375-SCF組(HS組)為穩定轉染hc-kit的A375細胞 + 10 ng/ml SCF。

1.2.4 細胞增殖、凋亡的分析 將A375細胞和hckit/A375細胞接種于24孔板，每孔5×103個細胞，37 ℃、5%CO2孵箱中培養4 h，待細胞貼壁、伸展；按上述分組，AS組和HS組中每孔加入10 ng/ml的rhSCF；此后8 d連續用MTT法測定各組細胞的增殖情況，于酶標比色計492 nm波長處測量吸光度值（A值）。每組3個復孔，取平均值，并繪制每組細胞的生長曲線。

取細胞匯合度達90%以上，擬傳代的A375細胞和hc-kit/A375細胞，按前述分組接種于50 ml培養瓶中，AS組和HS組中加入10 ng/ml的rhSCF，37 ℃、5%CO2孵箱培養3 d，制成細胞懸液，用Annexin V/FITC雙染色法檢測細胞的凋亡率。

將處于對數生長期的A375細胞和hc-kit/A375細胞以相同的細胞濃度（5×104個/ml）分別接種于6孔板中，每種細胞均接種6孔，其中3孔加入10 ng/ ml的SCF，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養72 h后收集細胞，PI染色，用流式細胞儀對細胞周期進行分析。

1.2.5 ELISA檢測細胞中VEGF、MMP-9及腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平 按分組分別收集各組細胞的培養上清，置于15 ml離心管中，1 000 r/min離心4 min，取上清液，分裝于EP管中，20 ℃保存。用VEGF、MMP-9及TNF-α ELISA試劑盒測定各組細胞的VEGF、MMP-9及TNF-α的水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，數據結果用均數±標準差（xˉ ±s）表示，所有實驗組間差異用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 構建穩定表達c-kit的黑素瘤細胞株hc-kit/A375

采用c-kit-WT pcDNA3.1 neo重組質粒轉染A375細胞后，用G418進行篩選獲得野生型人c-kit受體的細胞株hc-kit/A375細胞。提取hc-kit/A375細胞總RNA，進行逆轉錄反應，以反應產物為模板，P1、P2為上下游引物進行RT-PCR，擴增出hc-kit cDNA第700～1 302 bp片段，而未轉染的A375細胞則沒有擴增出相應大小的片段，證明在 RNA水平檢測到外源性hc-kit受體的轉錄（圖1）。

用流式細胞儀分析hc-kit/A375細胞表面hc-kit受體的表達情況，結果hc-kit/A375細胞表面hc-kit受體分布明顯多于未轉染細胞，A組c-kit的表達為0.526±0.288，H組c-kit的表達為1.70±0.541（P＜0.05）（圖2），提示轉染后得到的細胞株表面c-kit受體的表達明顯增強，說明c-kit被成功轉染入A375細胞。

圖1 RT-PCR產物電泳圖

2.2 各組細胞的增殖曲線

采用MTT法檢測轉染前后及rhSCF干預前后8 d細胞的增殖情況（圖3）。生長曲線顯示轉染后細胞（hc-kit/A375）的增殖能力明顯低于未轉染細胞（A375）。加入10 ng/ml的rhSCF后轉染前及轉染后A375細胞的增殖能力明顯低于無干預組，且轉染后細胞（hc-kit/A375）的增殖能力明顯低于其他各組細胞。生長至第5天時，H組、HS組、AS組與對照A組間的差異均有統計學意義（P均＜0.05）。其中HS組細胞的增殖能力減弱最明顯，與其他各組相比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。這說明通過轉染增加黑素瘤細胞中c-kit的表達能有效抑制腫瘤細胞的增殖，而加入外源性的SCF后該作用明顯增強。

2.3 細胞凋亡的檢測

各組細胞在相同的培養條件下培養3 d后，用Annexin/PI雙染色法檢測細胞的凋亡情況，結果顯示，轉染后hc-kit/A375細胞的凋亡率為2.7%，明顯高于未轉染組A375細胞（0.9%）。加入10 ng/ml的rhSCF后轉染前及轉染后A375細胞的凋亡率（分別為1.6%，8.5%）明顯高于A組（0.9%），且轉染后細胞（hc-kit/A375）的凋亡率為8.5%，明顯高于其他各組細胞（圖4）。這說明通過轉染增加黑素瘤細胞中c-kit的表達，能有效促進腫瘤細胞的凋亡； 而加入外源性的SCF后該作用明顯增強。

圖2 流式細胞儀分析A375細胞及hc-ki t/A375細胞表面c-ki t表達水平

圖3 M TT法檢測各組細胞生長曲線

圖4 流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況

2.4 細胞周期的檢測

流式細胞儀對細胞周期的檢測結果見圖5。各細胞S期在細胞周期中所占比例依次為：A375(41.5%)＞A375-SCF(39.3%)＞ hc-kit/A375(32.2%)＞hc-kit/ A375-SCF(30.6%)。hc-kit/A375細胞的S期在細胞周期中所占比例明顯低于A375和A375-SCF細胞，而hc-kit/A375-SCF組細胞的S期在細胞周期中所占比例最低，提示hc-kit/A375和hc-kit/A375-SCF組細胞的增殖活躍程度受到明顯抑制。

2.5 細胞VEGF、MMP-9及TNF-α的表達

未轉染的A375細胞培養上清液中可以檢測到大量VEGF和MMP-9的表達，分別為(698.75± 45.01) pg/ml和(12.75±1.71) ng/ml。而在轉染后的hckit/A375細胞培養上清液中VEGF和MMP-9的表達明顯降低，分別為(174.37±39.69) pg/ml和(7.75±2.63) ng/ml。加入rhSCF進行干預后，兩者的表達均有明顯降低，各組間比較，P均＜0.05，差異有統計學意義。

未轉染細胞的A375培養上清液中僅檢出極少量的TNF-α表達，在穩定轉染c-kit的A375細胞培養上清液中檢測出少量TNF-α。加入外源性rhSCF進行培養后，TNF-α的表達明顯增加（表1）。

3 討論

3.1 構建穩定表達c-kit的A375細胞株

本實驗使用Invitrogen公司生產的lipofectine 2000介導c-kit-WT pcDNA3.1 neo重組質粒轉入體外培養的A375細胞，雖然在本實驗中未對轉染率進行直接檢測，但通過G418抗性篩選14 d后，我們獲得了多株陽性克隆，這間接說明通過該陽性脂質體介導取得了良好的轉染效果。而RT-PCR和流式細胞儀檢測發現轉染后A375細胞中c-kit表達增加，更加證實了這一點。G418是一種氨基糖苷類抗生素，其結構與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，在分子遺傳試驗中，是穩定轉染最常用的抗性篩選試劑。

研究表明，c-kit在黑素細胞的增殖和分化中起著重要的調節作用，且隨著黑素瘤的生長和轉移，c-kit的表達逐漸減弱甚至缺失[4-6]。這一事實在體外培養的各類黑素瘤細胞中也得到了證實，大多數的人黑素瘤細胞株均不表達c-kit。本實驗中選用的黑素瘤細胞A375具有較強的增殖和轉移能力，且在體外培養條件下無c-kit的表達。而本實驗通過流式細胞儀分析發現, A375 細胞中也有少量c-kit表達，這與國外學者的研究結果不同[6]。但本實驗A375細胞中c-kit的濃度很低，這與我們研究所需的高表達c-kit的腫瘤細胞仍有本質的區別，因此并不影響本研究結果。

目前，關于SCF/c-kit對轉移性黑素瘤的作用研究主要是通過瞬時轉染的方法進行的。瞬時轉染獲得的細胞只能在數天內進行研究，無法對c-kit的長期作用進行研究。而我們成功構建了穩定表達c-kit的A375細胞，并在后續的研究中證明該細胞傳10代后和反復凍融仍有明顯的c-kit表達。這在目前關于SCF/c-kit對黑素瘤的研究中罕見報道，也為我們建立研究rhSCF/c-kit信號轉導途徑在黑素瘤的發生和發展中作用的細胞模型提供了可行性依據。

3.2 SCF/c-kit對黑素瘤細胞增殖的影響

c-kit在正常黑素細胞及良性黑痣中的表達呈強陽性；而在轉移性黑素瘤的細胞中常常缺乏c-kit的表達，且c-kit的表達與腫瘤之間呈負相關[4-6]。本實驗中所選用的黑素瘤細胞A375屬于惡性程度較高的黑素瘤細胞，在體外實驗證實僅有少量的c-kit表達，這與其惡性程度相一致。而本實驗中所構建的穩定表達c-kit的A375細胞株，c-kit的表達明顯增加，且該細胞的的生物學性質發生改變，主要表現在：①生長曲線：我們發現hc-kit/ A375細胞的增殖較未轉染組細胞A375受到抑制，且在細胞生長至第5 d時，其抑制作用達到頂點。而給予外源性的SCF后細胞的增殖同樣受到抑制，且當SCF與c-kit均增加時，對細胞增殖的抑制作用尤為明顯。②細胞周期：hc-kit/A375細胞的DNA合成期（S期）在細胞周期中所占比例明顯低于A375和A375-SCF細胞的S期，而hc-kit/A375-SCF組細胞的S期在細胞周期中所占的比例最低，而DNA合成期所占比例反映了細胞的增殖強弱。因此本研究結果提示hc-kit/A375和hc-kit/A375-SCF組細胞的增殖明顯弱于A375細胞。由此可見，單獨的SCF或c-kit均能抑制黑素瘤細胞的增殖，這與國外學者的研究結果一致。本研究對SCF，c-kit單獨作用及兩者共同作用下黑素瘤細胞A375 的增殖進行了研究和對比，使SCF及c-kit對腫瘤細胞的作用有更全面的認識。實驗發現在兩者共同作用下，能更有效地抑制細胞的增殖。

表1 各組細胞VEGF、M M P-9和TN F-α的表達比較 （±s）

表1 各組細胞VEGF、M M P-9和TN F-α的表達比較 （±s）

注：與A375細胞組比較，*P＜0.05；組間比較，#P＜0.05

組 別 VEGF（pg/ml）MMP-9 (ng/ml) TNF-α（pg/ml）A375細胞組698.75±45.0112.75±1.71112.00±20.45 A375-SCF組483.89±24.75*#10.25±3.37*#64.68±20.24*#hc-kit/A375組 174.37±79.38*#7.75±2.63*#17.35±2.06*#hc-kit/A375-SCF組126.15±14.79*#5.43±1.22*#11.07±3.24*#

SCF/c-kit抑制細胞增殖的作用機制尚不清楚，可能與下列因素有關：①SCF可通過調節蛋白激酶C(PKC)的活性誘導細胞凋亡，從而抑制c-kit表達陽性的黑素瘤細胞增殖。②SCF/c-kit信號可能負責控制黑素瘤細胞黏連分子（MCAM） 的合成。MCAM 在黑素瘤細胞表達上調通常伴有腫瘤細胞增殖加速和轉移。細胞丟失 c-kit受體后，MCAM便得以表達，進而使黑素瘤發生惡變、增生[7]。③SCF通過下調與黑素瘤生長有關的細胞因子的表達，如IL-7、IL-8、IL-10、GM-CSF及TGF-β等，從而抑制黑素瘤的增生速度[8]，這一點在本實驗中也得到了證實。本實驗結果提示SCF/c-kit可能通過抑制細胞的DNA合成抑制細胞的增殖。

3.3 SCF/c-kit對黑素瘤細胞凋亡的影響

細胞凋亡異常在大多數惡性腫瘤的發病學上具有重要地位[9]。大量研究表明惡性黑素瘤與其他惡性腫瘤相比，其腫瘤細胞的自發凋亡水平較低，提示其凋亡不足與其侵襲、轉移及治療耐受性相關[10]。在本實驗中，增加A375細胞c-kit的表達后，細胞的凋亡率明顯增加。在SCF與c-kit的共同作用下，能更有效地促進細胞的凋亡，這與國外學者的研究結果一致[11]。

細胞凋亡功能的失調在影響黑素瘤的生物學行為上起重要作用。而大多數凋亡信號途徑依賴于TNF-α。TNF-α是由炎性細胞分泌的細胞因子，通過與細胞膜表面TNF-α受體結合，激活細胞內信號傳導系統，引起多種正常細胞及腫瘤細胞的凋亡[12,13]。在本實驗中，在c-kit及SCF的作用下， A375細胞分泌的TNF-α增加，這可能是SCF/c-kit促進黑素瘤細胞凋亡的機制之一。

3.4 SCF/c-kit對黑素瘤細胞VEGF和MMP-9表達的影響

腫瘤的發生、發展是一個多階段、多因素參與調控的漫長過程，在這過程中惡性腫瘤必須依靠機體的血液供應進行生長，同時通過降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM）引起轉移及浸潤性生長。在這個過程中VEGF[14]和MMPs起著重要作用[15]。

大量研究發現，VEGF在惡性黑素瘤中的表達隨著腫瘤惡性程度的增加而增加，且在腫瘤的生長、轉移和浸潤中起重要的作用[16,17]。在腫瘤浸潤、轉移的過程中，ECM是癌細胞脫落游走的主要障礙。惡性腫瘤的浸潤很大程度上依賴于腫瘤細胞外周基質成分的降解，研究表明 MMPs在這一過程中起關鍵作用。MMPs是一組具有高度同源性的能降解基膜等基質成分的水解酶，MMPs在很多惡性腫瘤中均有較高水平的表達，發揮降解細胞外基質等作用，并與許多腫瘤細胞的浸潤呈正相關。其中，MMP-9因能降解基膜和多種細胞外基質成分而倍受關注。同樣MMP-9在惡性黑素瘤中的表達與腫瘤的轉移性侵襲成正相關。

目前關于SCF/c-kit對轉移性黑素瘤的生長、轉移抑制作用機制的研究尚不多，有研究證實SCF/c-kit可能通過抑制MCAM抑制黑素瘤轉移[7]。但腫瘤的轉移和多種因素有關，其中腫瘤細胞通過自分泌或旁分泌的形式分泌細胞因子起著重要的作用。本研究顯示，黑素瘤細胞A375中VEGF和MMP-9的表達明顯高于穩定表達c-kit的A375細胞，同時在SCF干預后，兩者的表達均明顯降低。這一結果提示SCF/ c-kit可能通過下調腫瘤細胞VEGF和MMP-9的表達，抑制黑素瘤的生長和轉移。

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The effect of SCF and its receptor c-kit on A375 cell proliferation and apoptosis in vivo

WU Dong-mei，CEN Ying

Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610031, China

ObjectiveTo establish malignant melanoma cells A375 which stably expressing the human stem cell factor receptor c-kit and observe the effect of exogenous SCF/c-kit on cell growth and apoptosis.MethodsBy liposomal transfection technology, cell line which stably expressing c-kit receptor(hc-kit/A375) was established. Then exogenous SCF was given to A375 cells and hc-kit/A375 cells, all the cells were divided into four groups: A375 group, A375-SCF group, hc-kit/A375 group and hc-kit/A375-SCF group, then the cell growth and apoptosis were observed by MTT method and fl ow cytometry. ELISA and immunohistochemistry staining were used to confi rm the effect of SCF/c-kit on expression of VEGF, MMP-9, TNF-α.ResultThe recombinant plasmid c-kit-pcDNA3.1 neo was successfully transfected into melanoma cells, and the cell line hc-kit/A375 which stably expressing c-kit was established. C-kit expression was signifi cantly increased in the cell line hc-kit/A375. After exogenous SCF was given, the cell growth was restrained, especially in the fifth day; cell apoptosis rate significantly increased; S phase ratio was reduced, and the hc-kit/A375-SCF group was especially apparent. ELISA analysis and immunohistochemitry staining of the cells confi rmed that SCF/c-kit can reduce the expression of VEGF and MMP-9 of A375 cell, contrarily the expression of TNF-a increased.ConclusionThrough the liposome transfection and G418 selection we successfully established A375 cells which stably expressing c-kit; increased expression of SCF/c-kit in A375 cell can depress the cell growth and enhance the cell apoptosis by increasing the expression of TNF-α and reducing the expression of VEGF, MMP-9.

Malignant melanoma，metastasis；Stem cell factor；Receptor c-kit；Stable transfection；Cell，A375

R393；R739.5

A

1674-1293(2012)04-0193-06

2012-05-05

2012-06-26）

（本文編輯 耿建麗）

610031 成都，四川省人民醫院皮膚外科（吳冬梅）；四川大學華西醫院燒傷整形科（岑瑛）

吳冬梅，博士，主治醫師，研究方向：皮膚腫瘤的診斷和基因治療、瘢痕的綜合治療，E-mail: sunsearch@163.com

岑瑛，E-mail: 191376086@qq.com