Dyrk1A經ASF調控CaMKⅡδ可變剪接在腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚中的作用*

姚 健， 朱健華， 陸盡亞，3， 秦曉同， 于小紅， 盛紅專△

(南通大學1附屬醫(yī)院心內科，2醫(yī)學院組胚教研室，3南通市第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學科，江蘇南通226001)

心肌肥厚是心肌細胞對多種心血管刺激的代償性反應，可由壓力超負荷、損傷和神經激素活化引起［1］。心肌肥厚可導致多種心血管意外如心肌梗死、心律失常、心衰等的發(fā)生率顯著增加，預防心肌肥厚可以明顯改善心臟病患者的預后。

鈣/鈣調素依賴蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)是介導心肌肥厚的重要激酶［2］。心臟組織中主要表達CaMKⅡ的δ亞型［3］，由于外顯子14、15或者16的可變剪接，CaMKⅡδ可表達A、B、C 3種亞型，正常機體內CaMKⅡδ的可變剪接受著嚴格的調控。可變剪接因子(alternative splicing factor，ASF)在心肌CaMKⅡδ可變剪接的調控中發(fā)揮關鍵作用［4］。ASF是受磷酸化高度調控的蛋白，前期本課題組通過轉基因細胞研究的方法發(fā)現，雙特異性酪氨酸磷酸化調節(jié)激酶1A(dual－specificity tyrosine phosphorylation－regulated kinase 1A，Dyrk1A)可磷酸化 ASF，從而使其移位，失去對可變剪接的調控作用［5］，提示存在Dyrk1A經ASF調控CaMKⅡδ可變剪接的信號通路，但該通路在心肌肥厚中的作用尚未見研究報道。

本實驗利用兩腎一夾(two－kidney one－clip，2K1C)的大鼠心肌肥厚模型，通過檢測大鼠心肌肥厚過程中CaMKⅡδ亞型可變剪接的改變及Dyrk1A、ASF表達的變化，并分別應用Dyrk1A抑制劑——表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)和哈爾堿(harmine)干預，探討EGCG和哈爾堿對心肌肥厚、CaMKⅡδ可變剪接和ASF、Dyrk1A蛋白表達的影響，闡明心肌中 Dyrk1A經 ASF對CaMKⅡδ可變剪接的調控在腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚中的作用。

材料和方法

1 動物

采用健康、雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠32只，清潔級，體重(174±9)g，購于上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK(滬)2008－0016。

2 方法

2.1 動物心肌肥厚模型的制備與分組 大鼠隨機分為4組:假手術組(sham組)、兩腎一夾組(2K1C組)、EGCG組和哈爾堿組，每組8只。大鼠以2%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，從腹部正中切口，分離左腎動脈，以直徑0.2 mm的U型銀夾鉗夾左腎動脈，右腎動脈不觸及。假手術組不夾左腎動脈，其余步驟同手術組。EGCG組及哈爾堿組大鼠在兩腎一夾基礎上分別喂以EGCG 100 mg·kg－1·d－1和哈爾堿 15 mg·kg－1·d－1，假手術組和2K1C 組大鼠喂以等量生理鹽水，共8周。

2.2 大鼠血壓、心肌標本采集與重量測定 術后8周，稱取大鼠體重(body weight，BW)，2%戊巴比妥鈉2 mL/kg腹腔注射麻醉后分離左側頸總動脈，插入內充有肝素及生理鹽水的導管，記錄動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，隨后處死大鼠，稱取左心室重量(left ventricular weight，LVW)，計算左室重與體重比值(LVW/BW);取左室游離壁心肌組織，立即置入10%甲醛中，石蠟包埋切片，Masson染色，以Leica Q550 IW圖像分析儀計算橫截面跨核的心肌細胞面積。余左室組織經液氮冷凍后于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 免疫印跡法檢測Dyrk1A和ASF蛋白質表達取大鼠左室心肌組織100 mg，提取心肌胞漿蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用濕轉法將蛋白轉移到聚氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉，加Ⅰ抗，4℃過夜，加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，顯色，凝膠成像系統分析結果，以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參照，以目的條帶與GAPDH的吸光度比值表示蛋白表達水平。小鼠抗大鼠Dyrk1A單克隆抗體由南通大學神經再生重點實驗室劉飛教授惠贈;小鼠抗大鼠ASF單克隆抗體、小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體及共同的羊抗小鼠Ⅱ抗均購自Santa Cruz。

2.4 逆轉錄－多聚酶鏈反應法檢測CaMKⅡδ可變剪接 取大鼠左室心肌組織50～100 mg，用Trizol法提取RNA，在紫外分光光度計260 nm處測樣品RNA濃度。取樣品 RNA 5 μg逆轉錄為 cDNA，取cDNA 1 μg行PCR擴增。25 μL PCR 反應體系:2×PCR MasterMix(北京天根)12.5 μL 、cDNA 1 μg、20 μmol/L 雙向引物各1 μL ，ddH2O 補足至25 μL。凝膠成像系統分析結果，以GAPDH為內參照，以目的條帶與GAPDH的吸光度比值表示mRNA表達水平。反應條件為:98℃預變性5 min，98℃ 30 s，62℃ 45 s，72℃ 45 s，共35 個循環(huán)，72℃延伸 5 min。引物序列分別為:GAPDH［14］上游引物 5'－ATTGCATCCTGCACCACCAACTGC－3'，下游引物 5'－GGAGGCCATGTAGGCCATGAGGTC－3';CaMKⅡδ上游引物［4］5'－CGAGAAATTTTTCAGCAGCC－3'，下游引物 A［4］5'－ACAGTAGTTTGGGGCTCCAG－3'，下游引物 B［4］5'－GCTCTCAGTTGACTCCATCATC－3'，下游引物 C［4］5'－CTCAGTTGACTCCTTTACCCC－3'。

3 統計學處理

采用SPSS Statistics 17.0統計軟件分析，數據以均數±標準差(±s)表示，均數比較采用單因素方差分析及q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠心肌肥厚程度及血壓的變化

兩腎一夾術后8周，2K1C組大鼠收縮壓和舒張壓較假手術組分別升高了51%和56%(P＜0.05)，提示大鼠高血壓模型制備成功;同時2K1C組大鼠LVW和LVW/BW較假手術組升高(P＜0.05)，大鼠心肌病理切片觀察發(fā)現手術組大鼠心肌細胞面積較假手術組增大(P＜0.05)，上述結果均表明該組大鼠發(fā)生心肌肥厚。與2K1C組相比，EGCG組及哈爾堿組大鼠LVW、LVW/BW及心肌細胞面積均顯著下降(P＜0.05)，與假手術組相比無明顯差異，提示EGCG及哈爾堿可以防止腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚的發(fā)生;同時發(fā)現EGCG及哈爾堿組大鼠血壓與2K1C組相似，顯著高于假手術組(P＜0.05)，提示EGCG和哈爾堿預防心肌肥厚與血壓無關，見圖1、表1。

Figure 1.Masson trichrome staining of rat myocardium in different groups.Bar=25 μm.A:sham;B:2K1C;C:EGCG;D:harmine.圖1 各組大鼠心肌Masson染色結果

表1 大鼠心肌肥厚程度與血壓的變化Table 1.The changes of cardiac hypertrophy and blood pressure in rats(±s.n=8)

表1 大鼠心肌肥厚程度與血壓的變化Table 1.The changes of cardiac hypertrophy and blood pressure in rats(±s.n=8)

*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs 2K1C group.

Group Sham 2K1C EGCG Harmine SBP(mmHg) 119.9 ±21.3 180.8±23.5* 172.0 ±21.6* 174.4±19.7*DBP(mmHg) 75.9±20.1 119.5±17.0* 115.2 ±15.1* 112.4±14.1*LVW(mg) 839.4 ±48.01 062.9 ±71.1* 844.5±57.6# 872.2 ±114.6#LVW/BW(mg/g)2.19±0.22 2.49±0.11* 2.21±0.04# 2.23±0.11#Area(μm2) 153.6±75.7 368.8±73.0* 168.3±50.0# 187.6±36.9#

2 CaMKⅡδ可變剪接的改變

兩腎一夾術后8周，2K1C組大鼠心肌CaMKⅡδ可變剪接表現為A、B亞型mRNA表達與假手術組相比升高，分別為假手術組的2倍和2.5倍(P＜0.05)，CaMKⅡδC亞型mRNA表達顯著下降，為假手術組的53%(P＜0.05);與2K1C組相比，EGCG組CaMKⅡδA、B亞型mRNA表達下降，分別為2K1C組的48%和43%(P＜0.05)，CaMKⅡδC亞型 mRNA表達升高，為2K1C組的1.7倍(P＜0.05);哈爾堿組大鼠與2K1C組相比，CaMKⅡδA、B亞型mRNA表達下降，分別為2K1C組的51%和45%(P＜0.05)，CaMKⅡδC亞型mRNA表達升高，為2K1C組的1.8倍(P＜0.05);與假手術組相比，EGCG和哈爾堿組CaMKⅡδA、B、C 3種亞型mRNA表達均無顯著差異(P ＞0.05)，見圖2、表2。

Figure 2.Changes of CaMK II δA，B and C mRNA expression in the myocardium of rats.M:marker;1，2:sham;3，4:2K1C;5，6:EGCG;7，8:harmine.圖2 大鼠心肌CaMK II δA、B、C亞型mRNA表達變化

表2 不同組別大鼠CaMK II δA、B、C亞型mRNA表達的比較Table 2.The comparison of CaMK II δA，B，C mRNA expression in different groups(±s.n=8)

表2 不同組別大鼠CaMK II δA、B、C亞型mRNA表達的比較Table 2.The comparison of CaMK II δA，B，C mRNA expression in different groups(±s.n=8)

*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs 2K1C group.

Group CaMK II δA CaMK II δB CaMK II δC Sham 0.051 ±0.014 0.174 ±0.028 0.143 ±0.019 2K1C 0.106 ±0.011* 0.447 ±0.050* 0.076 ±0.009*EGCG 0.051 ±0.007# 0.194 ±0.023# 0.131 ±0.012#Harmine 0.054 ±0.008# 0.203 ±0.022# 0.136 ±0.025#

3 大鼠心肌Dyrk1A蛋白質表達的變化

大鼠心肌Dyrk1A蛋白質表達以Dyrk1A蛋白與GAPDH蛋白條帶的吸光度比值表示。2K1C組大鼠左室心肌Dyrk1A蛋白表達為1.651±0.282，較假手術組(0.585±0.108)升高1.8倍(P＜0.05);EGCG組Dyrk1A蛋白表達為0.828±0.147，較2K1C組下降50%(P＜0.05);哈爾堿組Dyrk1A蛋白表達為0.909±0.099，較2K1C組顯著下降，為2K1C組的55%(P ＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The changes of Dyrk1A protein expression in the myocardium of rats.±s.n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs 2K1C group.圖3 大鼠心肌Dyrk1A蛋白質表達的變化

4 大鼠心肌ASF蛋白質表達的變化

大鼠心肌ASF蛋白質表達以ASF蛋白與GAPDH蛋白條帶的吸光度比值表示。2K1C組大鼠左室心肌ASF蛋白表達為0.150±0.022，較假手術組下降，表達量是假手術組 ASF蛋白表達(0.310±0.023)的48%(P＜0.05);EGCG組為0.304±0.041，較2K1C顯著升高，表達量為2K1C組的2.0倍;哈爾堿組 ASF蛋白表達為 0.318±0.036，為2K1C組的2.1倍(P＜0.05)，見圖4。

討 論

本實驗利用兩腎一夾的大鼠模型發(fā)現:術后8周，2K1C組大鼠收縮壓、舒張壓、LVW、LVW/BW和心肌細胞面積較假手術組顯著升高，提示模型制備成功，大鼠血壓升高并發(fā)生了心肌肥厚。實驗同時發(fā)現在肥厚心肌中存在CaMKⅡδ的可變剪接調控紊亂，表現為CaMKⅡδA、B亞型mRNA表達升高，CaMKⅡδC亞型mRNA表達下調;Dryk1A抑制劑EGCG、哈爾堿在預防心肌肥厚同時，可改善CaMKⅡδ的可變剪接調控紊亂，表現為下調CaMKⅡδA、B亞型mRNA表達，并使CaMKⅡδC亞型mRNA表達升高。上述結果提示CaMKⅡδ的可變剪接調控紊亂參與了腎血管性高血壓大鼠的心肌肥厚過程，也證實 CaMKⅡδ 是介導心肌肥厚的重要激酶［2，6－9］。

Figure 4.The changes of ASF protein expression in the myocardium of rats.±s.n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs 2K1C group.圖4 大鼠心肌ASF蛋白質表達的變化

ASF是一種富含精氨酸和絲氨酸的剪接體，參與多種前體mRNA分子的可變剪接［10］。在ASF基因心臟靶向敲除的小鼠中發(fā)現，CaMKⅡδ的剪接產物發(fā)生了變化，CaMKⅡδB表達增加，而CaMKⅡδC的表達下降，引起心臟心肌興奮偶聯機制失調，心肌肥厚，進而引起擴張性心肌病和心力衰竭［4］，提示ASF參與了CaMKⅡδ的可變剪接。前期我們利用已構建的CaMKⅡδ minigene和ASF共轉染COS－7或H293T細胞，發(fā)現ASF可促進 CaMKⅡδC表達，而δA和δB表達均下降，也證實了ASF對CaMKⅡδ可變剪接的調控作用［11］。ASF是受磷酸化高度調控的蛋白，不同的磷酸化水平可影響其細胞內定位和功能。Dyrk1A是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，位于人類21號染色體的關鍵區(qū)域［12］。本課題組最近的研究顯示Dyrk1A可磷酸化ASF，促進它轉位到無活性絲氨酸/精氨酸豐富蛋白存儲部位——核斑，從而抑制ASF結合到新生轉錄體，失去對可變剪接基因的調節(jié)作用［5］，提示存在Dyrk1A經 ASF調控 CaMKⅡδ可變剪接的信號通路。

本實驗發(fā)現:與假手術組相比，2K1C組大鼠在心肌發(fā)生肥厚時，心肌中Dyrk1A蛋白表達上調，ASF蛋白表達下降(胞漿 ASF蛋白表達下調考慮與Dyrk1A致ASF磷酸化后移位至核斑有關)，同時心肌中CaMKⅡδ可變剪接調控紊亂。哈爾堿是目前發(fā)現的最具特異性和高效的Dyrk1A抑制劑［12－13］，兩腎一夾大鼠在給予哈爾堿干預后，大鼠LVW、LVW/BW及心肌細胞面積顯著下降，心肌肥厚程度減輕，同時心肌中存在Dyrk1A蛋白表達下降，胞漿ASF蛋白表達上調和CaMKⅡδ可變剪接調控改善，提示Dyrk1A經ASF調控CaMKⅡδ可變剪接調控的信號通路參與了腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚的過程。

EGCG提取自綠茶，是茶多酚生物活性的主要成份，近年研究認為EGCG是特異且安全的Dyrk1A抑制劑，可以保護由于Dyrk1A過表達引起的腦損傷［14］和減輕腹主動脈縮窄所致的大鼠心肌肥厚，進一步研究發(fā)現EGCG抑制心肌肥厚的機制部分與調節(jié)絲裂素活化蛋白激酶信號通路相關［15］。本實驗中，EGCG組大鼠LVW、LVW/BW及心肌細胞面積均顯著低于2K1C組，提示EGCG可預防腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚;EGCG在抑制心肌肥厚同時，大鼠心肌中Dyrk1A表達上調、胞漿ASF蛋白質表達下降及CaMKⅡδ可變剪接調控改善，提示EGCG抑制腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚與其對心肌中Dyrk1A－ASF－CaMKⅡδ可變剪接信號通路的抑制有關。

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