熊膽降熱丸中兒茶素在大鼠體內的藥代動力學研究

季 平，袁浩宇，林 勇，易 紅，王 鵬

(核工業四一六醫院，四川 成都 610051)

熊膽降熱丸是由熊膽、兒茶、大黃等七味中藥組方的復方制劑，具有清熱、解毒、通便等功效。兒茶素(catechin)為兒茶的主要成分，別名兒茶酸，為黃烷衍生物，具有防治心血管疾病、預防癌癥等多種功能[1－5]。目前，國內外對兒茶素類化合物的體內研究多集中在兒茶素體內代謝方面，也有少量關于兒茶素單體、表兒茶素單體或兒茶素脂質體經口服或靜脈注射給藥后在家兔、大鼠體內代謝研究的報道[6－9]，尚無兒茶中藥復方制劑中的兒茶素體內代謝研究的報道。筆者對大鼠口服熊膽降熱丸后兒茶素的藥代動力學進行了研究，為含兒茶中藥復方制劑的體內研究和臨床合理用藥提供參考。

1 儀器與試藥

LC－10ATvp型高效液相色譜儀(日本島津);SPD－10Avp型紫外檢測器;BS224S萬分之一電子天平(德國賽多利斯);pHS－3C型酸度計(成都方舟科技開發公司);LD4－2型臺式離心機(北京醫用離心機廠);YHK－Ⅱ型液體快速混合器(江西醫療器械廠)。熊膽降熱丸(四川大學藥學院藥劑教研室，規格為0.1 g，批號為061001)，兒茶素對照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號為110877－200602);乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。健康SD大鼠，體重250～300g，由四川大學華西動物中心提供，動物合格證為SCXK(川I)10－2006。試驗前適應性喂養1周。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil C18柱(250mm×4.6mm，10μm);流動相:乙腈－水－三乙胺(6 ∶94 ∶0.3，磷酸調節 pH=(4.0 ±0.1);檢測波長:205 nm;柱溫:40℃;流速:1mL/min。

2.2 溶液制備

精密稱取兒茶素對照品適量，用甲醇溶解成含兒茶素240mg/L的對照品貯備液，于冰箱－20℃貯存，4周內使用，臨用前用甲醇稀釋至所需濃度。取熊膽降熱丸10粒，研細，稱取細粉約0.3 g，置圓底燒瓶中，加水25mL浸泡24 h后于80℃水浴加熱1 h，過濾，取濾液，測定出提取液中兒茶素的濃度，作為熊膽降熱丸供試品溶液。

2.3 血樣處理方法

取血漿樣品 100μL，甲醇 －飽和硫酸鋅(1∶1)200μL，漩渦混合1min，以10 000 r/min的速度離心5min，精密量取上清液50μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖和峰面積，以外標法將測量值帶入隨行工作曲線，計算血漿中兒茶素的濃度。

2.4 方法學考察

專屬性考察:空白血漿、空白血漿加對照品、用藥后血漿樣品色譜圖見圖1。結果兒茶素在23.0 min左右出峰，峰形良好，血漿中內源性成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線制備:于100μL空白大鼠血漿中，加入不同濃度兒茶素對照品溶液 20μL，制成含兒茶素質量濃度依次為 0.12，0.24，0.48，1.2，2.4，4.8，9.6 mg/L 的溶液，照擬訂方法記錄色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標、兒茶素質量濃度(C)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 A=9.561 ×103C+83.6，(r=0.999 2)，定量限為 0.12 mg/L。結果表明，兒茶素在 0.12 ～ 9.6mg/L質量濃度范圍內，與峰面積線性關系良好。

回收率和精密度試驗:以空白血漿配制低、中、高(0.24、1.2和4.8mg/L)3個質量濃度的兒茶素標準系列各5份，按2.3項下方法操作，計算日內、日間變異系數，評價方法的精密度和準確度;以流動相代替空白血漿，制備低、中、高 (0.24，1.2，4.8 mg/L)3個質量濃度的兒茶素標準品溶液，按2.3項下方法操作，以血漿樣本與純品中兒茶素的峰面積比值計算提取回收率。結果低、中、高(0.24、1.2 和 4.8mg/L)3 個濃度的血漿樣品的日內及日間變異均低于15%，回收率為90.2% ～97.1%。見表1。

穩定性試驗:配制低、中、高(0.24，1.2，4.8mg/L)3 個質量濃度血漿樣品各3份;取1份，按2.3項下方法操作，分別于室溫下放置0，2，4，6 h后測定，考察樣品處理后在室溫條件下的穩定性;1份放置于－20℃ 冰箱中，反復凍融3次，考察反復凍融對藥物的影響;另1份在－20℃冰箱冷凍30 d后，考察藥物在冷凍時放置的穩定性。結果測定值的 RSD均小于10%，表明血漿樣品室溫下放置6 h、反復凍融和－20℃冰箱中冷凍保存30 d后穩定性均良好。

表1 精密度、準確度和提取回收率結果(n=5)

2.5 動物試驗

取8只大鼠，雌雄各半，在試驗前適應性喂養7 d。試驗前12 h禁食，全程不禁飲;灌胃給予熊膽降熱丸供試液，于給藥前及給藥后 0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，10，12，24 h 尾靜脈斷尾取血，分取血漿，置－20℃冰箱中保存待測。血藥濃度－時間曲線見圖2。用DAS2.0藥代動力學計算程序進行處理，計算藥代動力學參數。結果兒茶素在大鼠體內過程符合二室模型，藥代動力學參數見表2。

圖2 兒茶素均值血藥濃度－時間曲線(n=8)

表2 兒茶素口服給藥后的藥代動力學參數(n=8)

3 討論

大鼠單劑量口服熊膽降熱丸提取液(相當于兒茶素50mg/kg)后，兒茶素在體內的處置符合二室模型，約0.5 h達峰，吸收迅速;消除半衰期較慢，為(7.779±4.568)h;中心室分布容積為(19.635 ±8.632)L/kg，遠大于大鼠的體液總體積，說明分布廣泛。

對兒茶素對照品溶液(10μg/mL)進行紫外掃描(200～400nm)。結果兒茶素在280 nm波長處有吸收峰，在205 nm波長處有較強的末端吸收，其吸收強度約為前一波長處的2倍。故為提高體內分析的靈敏度，選擇205 nm為兒茶素血藥濃度的測定波長。

兒茶素母核上的氧原子和酚羥基與十八烷基硅烷鍵合硅膠上的殘余硅醇基可形成氫鍵，使色譜峰拖尾，加入三乙胺使峰的對稱性得到改善，三乙胺濃度為0.3%時最佳。在確定蛋白質沉淀劑時，筆者考察了3種蛋白沉淀劑:甲醇、乙腈、甲醇－飽和硫酸鋅溶液(1∶1)，使用甲醇－飽和硫酸鋅(1∶1)時，兒茶素的藥物釋出率最高，可能是因為當溶液pH＞p I時，蛋白質易與重金屬離子結合成不溶性的蛋白鹽而沉淀。

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