高壓氧對慢性疲勞綜合征大鼠血管內皮功能的影響

孟祥恩 張 禹 楊 晨 張敦曉 欒翔凌 潘曉雯

第二軍醫大學海軍臨床醫學院 海軍總醫院高壓氧科，北京 100048

慢性疲勞綜合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是一組全身性綜合征，主要為長期嚴重疲勞造成，以新發生的、持續性或反復發作的虛弱性疲勞為其基本特征，持續時間≥6個月，普通休息不能令其好轉，而在體格檢查和實驗室檢查方面未發現異常指標。患者一旦患有CFS，工作能力、效率及日常生活將受到嚴重影響，而在當今社會，“過勞死”這一嚴重的社會問題是隨著疾病的發展所導致最嚴重后果[1]。據報道[2]在美國每年經濟損失達到90 億美元，這是患CFS降低生產力所致。目前社會特點為生活節奏快，社會競爭激烈，這就使得人們容易產生精神和身體的疲勞，長此以往，這種疲勞愈發嚴重，這就使得該病的患者逐漸增多，與此同時原來只有在高年齡才會發生的高血壓、冠心病等慢性疾病愈發的年輕化，甚至有30歲出頭就并發生高血壓腦血管及心血管意外的病例，這給個人及整個家庭帶來嚴重的損害，而龐大的醫療及護理費用將給社會和家庭造成嚴重的經濟損失[3]。目前CFS的確切發病機制及病因還未明確，但隨著慢性疲勞綜合證大鼠動物模型被建立并被不斷完善，通過對于模型不斷的研究，筆者對該病的發病機制及相關組織器官的病理、生理變化，有了更加深入的認識，尤其在動物模型的基礎上，不光進行發病機制的研究，更重要的是可以通過模型試驗各種可能的治療方法，將理論應用于實踐，該病的治療研究方面將得到積極發展。高壓氧通常被認為是一種特殊環境下的物理治療方式，其廣泛被接受的治療機制為增加全身血氧分壓、氧含量和組織內氧氣的儲備量，從而達到維持缺血缺氧組織的新陳代謝，使全身內環境得到平衡。而隨著高氣壓醫學的不斷發展，高壓氧的其他治療機制越來越多地被發現，其中有多項報道指出，高壓氧治療對于急性運動疲勞有確切的療效[4-5]。在本實驗中，筆者用SD大鼠通過力負重竭游泳的方法建立慢性疲勞綜合征的動物模型，重點觀察慢性疲勞綜合征大鼠血管內皮功能的變化，即血漿內皮素-1（endothelin-1，ET-1）、一氧化氮（nitric oxide，NO）及血管性假血友病因子（von wille-brand Factor，vWF）三方面的影響，以及經過高壓氧治療以上3個指標的變化，從而更深入地研究CFS的發病機制，特別是對心血管造成的影響，以及高壓氧在治療該病方面的療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物選擇 雄性健康SD大鼠50只，清潔級，體重230～260 g，實驗動物由北京維通利華動物飼養中心提供[許可證編號SCXK（京）200720001]。飼養動物的環境：實驗室清潔飼養，溫度21～26℃，濕度50%左右，噪聲 <60 dB，工作照明：12 h明12 h暗。

1.1.2 儀器 大鼠實驗泳缸（本實驗室自制）；開闊箱（本實驗室自制）；爬桿架；電子秤；單人純氧艙。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組將50只SD大鼠每5只一籠，使其自由進食、飲水，適應性飼養3 d后，隨機分為5 組，每組10只大鼠。各組處理如下，①空白對照組：無需任何處理，在適宜環境下常規飼養；②高壓氧對照組：SD大鼠無需任何處理，僅在實驗第15 天給予高壓氧治療5次；③CFS模型組：僅給予力竭游泳進行動物模型制造；④CFS高壓氧組：給予力竭游泳進行動物模型制造，造模成功后給予高壓氧治療5次；⑤CFS休息組：給予力竭游泳進行動物模型制造，造模成功后給予單純休息5d。

1.2.2 制備CFS模型將5只SD大鼠單籠飼養，讓大鼠在基礎進食 （每只SD大鼠于安靜狀態下的進食量大約為大鼠體重的5%）的條件下力竭游泳，連續游泳訓練14 d。具體方法：將SD大鼠放在裝滿26℃左右水溫的游泳缸（60 cm×40 cm×100 cm）中進行負重的游泳，以每只大鼠各自體重的5%為負重量標準，采用1日2次的游泳方法，2次游泳間隔10 min，直到游泳至完全力竭。然后從水中將大鼠撈出后，熱風機將動物皮毛吹干。力竭的標準：SD大鼠肢體游泳動作特別失調、慌張，泳缸內游泳的范圍逐漸縮小，基本不會大范圍游動，僅在泳缸的一處勉強維持自己浮于水面；鼻尖部頻繁在水面上下浮動，頭部完全沒入水面下10 s不能浮出為力竭的標準。

1.2.3 高壓氧治療 單人純氧艙，洗艙時間30 min，壓力2.0 ATA，加壓時間5min，穩壓60 min，減壓時間5min，連續5d。

1.2.4 標本制備及檢測 空白對照組和CFS模型組在模型制備成功后（即實驗第14 天），立即用水合氯醛腹腔注射將兩組大鼠全麻，打開胸腔直視下經心腔取血，放置后將部分血清送交南京建成生物工程研究所，采用放射免疫法分別檢測ET-1、NO及vWF水平。CFS高壓氧組、CFS休息組及高壓氧對照組動物于CFS高壓氧組、高壓氧對照組高壓氧治療5次后（即實驗第19 天）立即用水合氯醛腹腔注射將3 組大鼠全麻，打開胸腔直視下經心腔取血，放置后將部分血清送交南京建成生物工程研究所采用放射免疫法分別檢測ET-1、NO及vWF水平。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 15.0 對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用多個樣本均數比較的方差分析，組間比較應用LSD-t及SNK-q法。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

與空白對照組比較，CFS模型組血清vWF、ET-1 值明顯上升，血清NO值明顯降低，差異均有高度統計學意義（均P<0.01）；CFS高壓氧組血清vWF、ET-1 明顯升高， 血清NO明顯降低，差異均有統計學意義（均P<0.05）。與高壓氧對照組比較，CFS模型組及CFS高壓氧組，上述指標也有同樣的變化趨勢（P<0.01 或P<0.05）。與CFS模型組比較，CFS高壓氧組血清vWF、ET-1 顯著降低，NO顯著升高，差異均有統計學意義 （均P<0.05）；CFS休息組與以上指標無明顯變化，差異均無統計學意義（均P>0.05）。與CFS高壓氧組比較，CFS休息組血清ET-1、vWF明顯上升，NO明顯降低，差異均有統計學意義（均P<0.05）。以上結果指出高壓氧治療對慢性疲勞綜合征大鼠有積極的治療作用，進一步證明了單純休息不能使該病得到緩解。見表1。

表1 不同組別之間ET-1、NO 及vWF比較（±s，n=10）

表1 不同組別之間ET-1、NO 及vWF比較（±s，n=10）

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高壓氧對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與 CFS 模型組比較，&P<0.05；與 CFS 高壓氧組比較，△P ＜0.05

組別 血管性假血友病因子（ng/mL）一氧化氮（μmol/L）血漿內皮素-1（ng/mL）空白對照組高壓氧對照組CFS模型組CFS高壓氧組CFS休息組3.88±0.40 4.19±0.42 6.16±0.36**#5.02.±0.31*#&6.03±0.40**△25.59±3.12 26.74±1.50 16.13±1.93**##20.24±2.31*#&15.41±1.79**△54.96±4.92 55.83±3.63 68.32±3.57**#60.04±5.69*#&65.52±4.54**△

3 討論

本研究顯示，ET-1、vWF值在CFS模型組大鼠較正常對照組明顯升高，相反，NO值明顯下降，這是CFS大鼠血管內皮功能受損或血管內皮功能功能發生紊亂的間接體現，在國內外相關報道中此類變化多被提及[5]。從解剖上，血管內皮是覆蓋在血管腔內表面的一類單層扁平細胞，在局部具有調節與營養細胞間聯系的功能，另外，其特殊的內分泌功能越來越受到重視并被廣泛關注，國內外相關研究提示，血管內皮細胞能分泌大量的血管活性物質，如纖維蛋白溶解酶原激活物抑制物（PAI）、vWF和ET-1 等；而血管內皮細胞不但是分泌細胞，它還存在許多受體，能與許多活性物質相結合，具有調節血管舒張狀態、維持凝血和纖溶系統的平衡、抑制血小板聚集、抑制炎癥細胞與血管內皮細胞間的黏附以及調控血管平滑肌生長等重要功能，同時，在調節血液循環、穩定內環境方面也起著重要作用。而血管內皮細胞發生損害或功能紊亂后，其釋放的各種血管活性物質的量就會發生改變，從而使原本正常的比例失調，試驗表明，這種血管活性物質釋放的比例失調與心血管疾病發生、發展有密切聯系[6]。

ET-1 主要是由血管內皮細胞產生并釋放的一類較強的縮血管物質，是由21個氨基酸殘基組成的血管活性多肽，存在3個同分異構體，均有較強縮血管作用[7]。ET-1 能與血管平滑肌纖維中Na+/Ca2+和Na+/H+交換受體相結合，通過離子交換使細胞內Ca2+的濃度升高，血管平滑肌纖維收縮，從而產生持續、強烈的縮血管作用[8]，是一種內源性損傷因子，可引起相關組織的缺血、缺氧。ET-1 受體主要分布于心血管系統，其濃度持續維持在高位可導致心肌細胞供血的血管持續收縮，從而發生心肌細胞的假性肥大，隨著病理生理的逐漸發展將導致心室壁重塑即向心性心肌肥厚，嚴重時將導致心臟泵血功能明顯下降，從而導致心功能衰竭的發生并危及患者生命[9]，特別是一旦發生心室重塑，將長期影響患者的生活質量。NO又稱內皮源性舒張因子，能使可溶性鳥苷酸環化酶被激活，從而使細胞內環磷酸鳥苷（cGMP）水平升高，進而引起血管平滑肌松弛、血管擴張和外周阻力下降，作為一種舒血管物質，對內皮素具有生理拮抗作用[10]，它們釋放的比例關系更影響到血管舒張狀態的調節；另外，抗血小板凝集、抗血栓形成和抑制血小板與其他細胞之間的黏附等作用也是NO的主要作用。ET-1 和NO是兩種血管內皮細胞釋放的主要的血管活性物質，兩者作用相反，前者為最強的縮血管因子，而后者是強效舒血管因子。通過調控NO和ET-1的釋放比例，血管內皮細胞可以使血管和血流變達到平衡，大多數心腦血管疾病的發生被認為是這種平衡被打破從而造成功能紊亂的結果，如高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟等多種心血管疾病的發生、發展與ET-1 與NO比值失調與冠心病有著密切聯系。

vWF是一種大分子糖蛋白，由血管內皮細胞和巨核細胞產生，是血小板糖蛋白在血管內皮上的配體，是血管內皮特有的因子，除一部分分泌到循環中和內皮下組織外，其余的儲存在棒管狀小體中。vWF的主要生理功能包括調節血小板黏附、促進血栓的形成、攜帶血漿因子、穩定其活性等。當正常生理情況下血管受到損傷時，棒管狀小體將vWF釋放入血[8]，從而促進血小板黏附，血栓形成，在修復血管的過程中發揮其積極作用，而過度vWF釋放，將導致包括血小板黏附障礙等一系列不良反應，從而引起血管內皮損傷或功能紊亂。有實驗提出，血漿vWF水平在高血壓患者中顯著升高，而通過治療血壓控制較好的患者，vWF水平又會降到正常，這說明解除血管收縮狀態，血管內皮細胞功能失調將得到緩解。實驗研究指出在血管內皮細胞功能受損時，vWF作為血管內皮分泌的活性物質，其數值的變化是十分敏感的指標[11]，有學者認為，vWF是血管內皮細胞功能紊亂的重要標志物[12]。

本研究提示相對于CFS模型組，CFS高壓氧組的ET-1、vWF降低明顯；NO明顯升高，說明高壓氧這種治療方法對CFS大鼠受損或紊亂的血管內皮細胞功能的恢復有積極的治療作用。高壓氧治療普遍的機制為大大提高了物理溶解在血中的氧分壓，從而提高血液中血氧含量、氧儲量及血氧彌散距離，使遠端缺氧、受損區域快速得到改善；而近年研究表明，高壓氧除了增加患者的血氧分壓，還有調節植物神經功能、穩定內環境、調整人體內分泌平衡以及改善血流動力學等方面的作用。高春錦等[13]通過實驗發現CO中毒大鼠血管內皮功能受到損傷，而高壓氧治療能改善其血管內皮功能，使升高的ET-1 及降低的NO逐漸恢復正常。高壓氧還可通過降低血小板聚集、清除老化紅細胞等作用降低血液黏滯度，從而改善血液流變學，進而達到改善動脈血液循環的作用；高壓氧治療還能通過降低細胞內的Ca2+，使細胞內的鈣超載的情況得到糾正，部分對抗ET-1 引起鈣超載導致的縮血管作用，以達到緩解血管平滑肌痙攣、收縮，使血管內皮細胞得到修復及從而改善其功能。同時，高壓氧治療可以通過緩解血管平滑肌的痙攣、收縮改善內皮細胞的缺氧狀態，促進內皮細胞的有氧代謝，使長期受損的內皮細胞得到修復，達到逐漸恢復血管內皮細胞功能的目的[7]。

但相對于空白對照組，CFS高壓氧組在以上3項指標上仍有一定差距，即ET-1、vWF仍較高，NO水平較低，考慮為以下3個因素導致：①對于受損或功能紊亂的內皮細胞高壓氧治療只能有部分積極作用，單純高壓氧治療不能達到治愈的目的，可能還需聯合應用其他治療方式，才能完全治愈；②僅給予慢性疲勞綜合征大鼠高壓氧治療5次，對于這一發病過程漫長的疾病來說，單次治療時間及總療程可能相對較短，還未能完全發揮高壓氧治療的積極作用；③本次試驗高壓氧治療所采用的壓力，為目前臨床普遍的治療壓力，對于CFS是否合適，提高或降低一些壓力能否使療效更好，有待進一步研究。另外，空白對照組與高壓氧對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），說明高壓氧對于正常健康SD大鼠血管內皮功能無影響，這從血清ET-1、vWF及NO水平可間接體現，這也從側面反映高壓氧治療的安全性。

綜上所述，心、腦血管疾病發生、發展均與血管內皮功能障礙有密切的聯系，其病理生理過程越來越被人們所認識。目前，血管內皮功能障礙被認為是是導致心肌梗死及腦血管意外發生的主要原因，長期過度的工作疲勞、生活的壓力過大、不科學的生活方式和不正確的飲食習慣，很可能導致慢性疲勞綜合征的發生，它已成為導致血管內皮損害的兇手之一，常此以往必將促成心腦血管意外的發生。然而，CFS如何誘發血管內皮功能紊亂，其發生的具體機制仍未能被發現，還需要進一步臨床及實驗研究來揭示這一機制，這將是十分漫長的過程。然而，更重要的是，在尋找慢性疲勞綜合征導致血管內皮功能障礙發生機制的同時，能夠找到減少、延緩或治療血管內皮功能障礙進展的方法有著更加現實的臨床意義。高壓氧治療對CFS大鼠血管內皮功能障礙有明顯的恢復作用，且對于正常大鼠無明顯副作用，為進一步安全地應用于臨床提供了寶貴的實驗依據。

[1] 李莉，盧洪洲.慢性疲勞綜合征研究進展[J].內科理論與實踐，2009，4（4）：331-333.

[2] Reynolds KJ，Vernon SD，Bouchery E，et al.The economic impact of chronic fatigue syndrome[J].Cost Eff Resour Alloc，2004，2：4-9.

[3] 陳明.高血壓病血管內皮功能障礙及治療[J].心血管病學進展，2005，26（3）：222-226.

[4] Jason LA，Porter N，Herrington J.Kindling and oxidative stress as contributors to myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome[J].J Behav Neurosci Res，2009，7（2）：1-17.

[5] 高懷林，吳以嶺，朱慧明，等.慢性疲勞綜合征動物模型的建立及對血管內皮功能的影響[J].中國中醫基礎醫學雜志，2009，15（12）：904-906，919.

[6] 袁春華，徐勁松，郭洋琴，等.間歇缺氧及睡眠剝奪大鼠血管內皮細胞相關指標的變化[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（37）：6919-6922.

[7] 宣浩宇.高壓氧對慢性充血性心力衰竭患者血漿內皮素-1 和心功能的影響[J].全科醫學臨床與教育，2011，9（5）：499-501.

[8] Lombardi VC，Ruscetti FW，Das GJ，et al.Detection of an infectious retrovirus，XMRV，in blood cells of patients with chronic fatigue syndrome[J].Science，2009，32（6）：585-589.

[9] Rehsia NS，Dhalla NS.Potential of endothelin-1 and vasopressinantagonists for the treatment of congestive heart failure [J].Heart Fail Rev，2010，15（1）：85-101.

[10] Simmons G，Glynn SA，Komaroff AL，et al.Failure to confirm XMRV/MLVs in the blood of patients with chronic fatigue syndrome：a multilaboratory study[J].Science，2011，11（334）：814-817.

[11] 楊冀萍，張聰敏，關繼濤.肺血栓栓塞癥患者血小板功能和血清抗磷脂抗體的變化及意義[J].中華結核和呼吸雜志，2004，27（11）：731-733.

[12] Leurs PB，Stolk RP，Hamulyak K，et al.Tissue factor pat hway in-hibitor and other endothelium dependent hemostatic factors in elderlyindividuals wit h normal or impaired glucose tolerance and type-diabetes[J].Diabetes Care，2002，2（5）：1340-1345.

[13] 高春錦，楊捷云，翟曉輝.高壓氧醫學基礎與臨床[M].北京：人民衛生出版社，2008：56-60.