枯草芽孢桿菌工程菌株產普魯蘭酶發酵條件的優化

劉逸寒，薄嘉鑫，王亞品，張志萌，王建玲，路福平

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

枯草芽孢桿菌工程菌株產普魯蘭酶發酵條件的優化

劉逸寒，薄嘉鑫，王亞品，張志萌，王建玲，路福平*

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

利用基因工程手段獲得的產長野芽孢桿菌普魯蘭酶的枯草芽孢桿菌基因工程菌株WB600/pWB-pulB，通過單因素篩選及正交試驗進行發酵培養基優化，得到產酶最佳配方為玉米淀粉3.0%，酵母膏2.0%，CaCl20.03%，Na2HPO41.0%。同時對重組菌株搖瓶條件下液體發酵的主要影響因素初始pH、接種量、裝液量、轉速、溫度等進行探討，確定了產酶最佳培養條件為，以3%接種量接種于優化后培養基，初始pH7.0，裝液量30 mL/250 mL，37℃，200 r/min搖床培養36 h。在此優化條件下，普魯蘭酶活力達到20.16 U/mL，是之前研究結果（10.94 U/mL）的1.84倍。

枯草芽孢桿菌工程菌株；長野芽孢桿菌；普魯蘭酶；發酵條件優化；酶活力

Abstract:The single factor comparative experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the liquid fermentation medium and conditions in shaking flasks of Bacillus subtilis WB600/pWB-pulB for producing the pullulanase.The composition of the best medium was corn starch 3.0%,yeast extract 2.0%,CaCl20.03%,Na2HPO41.0%.In addition,the optimal fermentation conditions in shaking flasks were the combination of the inoculums size 3%,initial pH 7.0,medium volume 30 mL/250 mL,temperature 37℃,and shaking at 200 r/min for 36 h.Under these conditions,the activity of recombinant pullulanase reached 20.16 U/mL,which was 1.84 times of before result(10.94 U/mL).

Key words：engineeredBacillussubtilis;Bacillusnaganoensis;pullulanase;fermentationconditionsoptimization;enzyme activity

淀粉質原料是迄今食品工業中應用最為廣泛的原料，為直鏈淀粉和支鏈淀粉構成的混合物，其中含有75%~85%的支鏈淀粉，其不能被分解可影響到淀粉的利用率。普魯蘭酶（Pullulanase，EC 3.2.1.41）是一種能夠專一性切開支鏈淀粉分支點中α-1，6糖苷鍵，從而切下整個側枝，形成直鏈淀粉的脫支酶[1-2]。由于其能將最小單位的支鏈分解，最大限度的利用淀粉原料，可大幅提高淀粉的利用率和生產效率，因此在以淀粉為原料的深加工工業中有著重要的用途及良好的市場前景[3]。單獨使用普魯蘭酶可將支鏈淀粉全部轉變成高純度直鏈淀粉；同時，其可與α-淀粉酶、β-淀粉酶共同作用淀粉，制得超高麥芽糖漿；在糖化階段其與糖化酶協同作用，能有效地提高淀粉的水解速率，提高葡萄糖的產量和純度[4]。

現今，普魯蘭酶的工業化生產菌株極少，僅有丹麥NOVO公司的B.acidopullulyticus和美國Genencor公司的B.deramificans等少數幾個菌株工業化生產的報道。國內食品工業上所用的普魯蘭酶全部依賴于國外進口，價格昂貴，造成生產成本較高。另外，目前國內外大多數普魯蘭酶的研究主要集中在產普魯蘭酶野生菌株的選育[5-6]、性能鑒定[7]、誘變改造[8]及發酵工藝優化[9-11]等手段提高普魯蘭酶的活力，但效果均不太理想。針對此種情況，本實驗室利用基因工程手段，構建獲得一株可表達長野芽孢桿菌ATCC53909普魯蘭酶（最適作用溫度范圍40℃~60℃，最適作用pH范圍4.5~5.0）枯草芽孢桿菌工程菌株WB600/pWB-pulB，其活力達到10.94 U/mL，是原始出發菌株（2.7 U/mL）的4倍左右，實現了普魯蘭酶的高效表達。

本實驗基于前期研究，對工程菌株WB600/pWB-pulB發酵培養基成分和發酵條件進行優化，以提高其生產普魯蘭酶的能力，為淀粉深加工行業提供具有耐酸及耐熱性能的普魯蘭酶奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

產長野芽孢桿菌普魯蘭酶枯草芽孢桿菌工程菌株WB600/pWB-pulB，由本實驗室構建并保藏。

1.1.2 儀器與設備

ZHWY-2102控溫搖床：上海志誠設備廠；TU-1810型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；高速冷凍離心機GL20A：日本日立有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器：江蘇國華儀器廠；HYG-FJ生物反應搖瓶柜：上海新蕊自動化設備有限公司。

1.1.3 培養基

斜面培養基/%：胰蛋白胨1，酵母浸出粉0.5，NaCl1，瓊脂粉2，卡那霉素0.003，pH自然。

種子培養基/%：胰蛋白胨1，酵母浸出粉0.5，NaCl1，卡那霉素0.003，pH自然。

初始發酵培養基/%：胰蛋白胨1，酵母浸出粉0.5，NaCl 1，pH 自然。

1.2 方法

1.2.1 發酵培養基的優化

分別對碳源、氮源、金屬離子、磷酸鹽的種類及濃度進行單因素試驗，然后由單因素試驗擬定A碳源、B氮源、C金屬離子、D磷酸鹽4個因素各取3個水平，以L（934）型正交試驗表進行試驗，以普魯蘭酶活力為指標，確定重組菌的培養基最佳配比。

1.2.2 發酵條件的優化

在優化得到的培養基基礎上對培養基初始pH、接種量、裝液量、轉速及發酵溫度等條件進行優化，以期得到最高活力的普魯蘭酶。

1.2.3 酶活的測定

酶活單位定義：在40℃，pH 6.0的條件下，每分鐘分解普魯蘭糖產生1 μmol葡萄糖所需的酶量，即為1 U。測定方法采用DNS顯色法[12]。

2 結果與分析

2.1 工程菌株發酵培養基的優化

2.1.1 碳源對產酶的影響

分別選取7種碳源進行單因素碳源對產酶影響的試驗，結果如圖1所示。

玉米淀粉是產酶的最佳碳源，普魯蘭酶活力達到最高，為7.72 U/mL。當玉米淀粉濃度為3.0%時，普魯蘭酶活力達到最高，為9.18 U/mL。

2.1.2 氮源對產酶的影響

分別選取7種氮源進行單因素氮源對產酶影響的試驗，結果如圖2所示。

酵母膏是產酶的最佳氮源，普魯蘭酶活力達到最高，為9.84 U/mL。當酵母膏濃度為2.0%時，普魯蘭酶活力達到最高，為10.98 U/mL。

2.1.3 不同金屬離子對產酶的影響

選擇6種金屬離子，比較不同金屬離子對菌體產酶的影響。結果表明，Zn2+、Fe2+對菌體產酶表現出抑制作用，K+、Na+對產酶沒有明顯促進或抑制，Ca2+、Mg2+促進產酶，其中Ca2+較Mg2+作用更為顯著。近一步研究不同濃度Ca2+對產酶的影響，結果如圖3所示。

由圖3可知，當添加0.04%Ca2+時，普魯蘭酶活力達到最高，為12.73 U/mL。因此，選擇0.04%為Ca2+最適濃度。

2.1.4 磷酸鹽濃度對產酶的影響

結果如圖4所示，當磷酸鹽濃度為0.8%時，普魯蘭酶活力達到最高，為13.87 U/mL。

2.1.5 正交試驗

在單因素試驗基礎上，以玉米粉、蛋白胨、CaCl2、磷酸鹽為因素，每個因素取3個水平，進行L9（34）正交試驗設計，具體因素水平見表1，結果及極差分析見表2。

表1 培養基配方正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels array of orthogonal experiment of medium components %

由表2可知，極差分析結果表明4個因素的影響程度依次為：酵母膏＞玉米淀粉＞Na2HPO4＞CaCl2。在玉米淀粉、酵母膏、CaCl2和Na2HPO44種培養基組分的不同配比中，產普魯蘭酶活力最佳組合為：玉米淀粉3.0%，酵母膏2.0%，CaCl20.03%，Na2HPO41.0%。對正交試驗中所得最佳組合進行驗證，普魯蘭酶活力達到14.72 U/mL，大于正交試驗中出現的所有結果，驗證了結果的正確性，說明所選培養基配比為最優組合。

表2 培養基配方正交試驗結果及其極差分析Table 2 Results and variance analysis of orthogonal experiment of medium components

2.2 工程菌株發酵條件的優化

2.2.1 培養基初始pH對產酶的影響

培養基初始pH對產酶的影響見圖5。

結果如圖5所示，初始pH為7（即培養基自然pH）時酶活力達到最高，為14.72 U/mL。初始pH過高或過低，酶活力均會下降。

2.2.2 接種量對產酶的影響

接種量對產酶的影響見圖6。

結果如圖6所示，當以3%的接種量進行發酵培養時，普魯蘭酶活力最高17.02 U/mL。因此，確定最佳接種量為3%。

2.2.3 裝液量對產酶的影響

裝液量對產酶的影響見圖7。

結果如圖7所示，裝液量30 mL時，普魯蘭酶活力達到最高，為19.05 U/mL。因此，確定30 mL/250 mL為最適裝液量。

2.2.4 搖床轉速對產酶的影響

搖床轉速對產酶的影響見圖8。

結果如圖8所示，當轉速為200 r/min時，普魯蘭酶活力達到最高，為20.16 U/mL。因此，確定200 r/min為最適搖床轉速。

2.2.5 溫度對產酶的影響

溫度對產酶的影響見圖9。

結果如圖9所示，當溫度37℃時，菌體的生長最旺盛，普魯蘭酶活力達到最高，為20.16 U/mL。因此，確定37℃為最適發酵溫度。

3 結論

目前，國內還未見長野芽孢桿菌普魯蘭酶基因在枯草芽孢桿菌中異源表達的報道。本實驗室利用枯草芽孢桿菌高拷貝表達載體pWB980及6個蛋白酶缺陷的枯草芽孢桿菌宿主菌株WB600，構建工程菌株WB600/pWB-pulB，實現了長野芽孢桿菌ATCC53909普魯蘭酶基因在枯草芽孢桿菌中的高效表達。本實驗在此基礎上，對工程菌株WB600/pWB-pulB發酵培養基成分和發酵條件進行優化。分別研究了碳源、氮源、金屬離子以及磷酸鹽對普魯蘭酶活力的影響，通過正交試驗進一步分析，確定最適發酵培養基為：玉米淀粉3.0%，酵母膏2.0%，CaCl20.03%，Na2HPO41.0%。同時，確定了搖瓶最佳發酵工藝：將重組菌的單菌落接種于種子培養基（50 mL/250 mL三角瓶）中，于37℃，200 r/min條件下培養16 h后，以3%接種量接種于優化后培養基（30mL/250mL三角瓶）中，初始pH7.0，37℃，200 r/min培養36 h后，普魯蘭酶活力達到20.16 U/mL，是之前研究結果(10.94 U/mL)的1.84倍。

[1]張樹政.酶制劑工業[M].北京:科學出版社,1998:77-83

[2]Ling H S,Ling T C,Mohamad R,et al.Characterization of pullulanase type II from Bacillus cereus H1.5[J].American journal of biochemistry and biotechnology,2009,5(4):170-179

[3]喬宇,丁宏標,王海燕,等.普魯蘭酶的研究進展[J].生物技術進展,2011,1(3):189-194

[4]周念波,孫杰,王晶,等.普魯蘭酶在食品工業中的應用[J].食品工程,2008(2):18-20

[5]Bertoldo C,Armbrecht M,Becker F,et al.Cloning,sequencing,and characterization of a heat-and alkali-stable type I pullulanase from Anaerobranca gottschalkii[J].Applied and environment microbiology,2004,70(6):3407-3416

[6]王淑軍,呂明生,李華鐘,等.深海古菌Thermococcus siculi HJ21高溫普魯蘭酶基因的克隆及表達[J].食品科學,2010,33(19):309-312

[7]NairSU,SinghalRS,KamatMY.Inductionofpullulanaseproduction in Bacillus cereus FDTA-13[J].Bioresource technology,2007,98(1):856-859

[8]郭宏文,鄒東恢,杜國軍,等.普魯蘭酶產生菌的誘變育種[J].食品研究與開發,2010,31(2):167-169

[9]朱夢,孫海彥,彭明.普魯蘭酶產生菌的篩選鑒定與發酵條件的研究[J].食品研究與開發,2011,32(7):136-140

[10]鞏培,戚薇,杜連祥,等.產氣氣桿菌產普魯蘭酶發酵培養基的優化[J].天津科技大學學報,2009,24(3):1-12,42

[11]Vester-Christensen M B,Hachem M A,Naested H,et al.Secretory expression of functional barley limit dextrinase by Pichia pastoris using high cell-density fermentation[J].Protein expression and purification,2010,69(1):112-119

[12]Miller GL.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J].Analytical chemistry,1959,31(3):426-428

Optimization of Fermentation Conditions for the Pullulanase Production by Engineered Bacillus subtilis

LIU Yi-han,BO Jia-xin,WANG Ya-pin,ZHANG Zhi-meng,WANG Jian-ling,LU Fu-ping*
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes,Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,The College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

2012-06-10

“十二五”農村領域國家科技計劃（2011AA100905－4）；國家自然科學基金（31101219）

劉逸寒（1982—），男（漢），講師，博士，研究方向：應用微生物與酶工程。

*通信作者：路福平，男，教授，研究方向：應用微生物與酶工程。