4-α-糖基轉移酶及其應用研究進展*

李學紅，王冰，陸勇，張勇

(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州，450002)

4-α-糖基轉移酶及其應用研究進展*

李學紅，王冰，陸勇，張勇

(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州，450002)

4-α-糖基轉移酶(EC 2.4.1.25)主要催化葡萄糖片段在α-葡聚糖分子中的轉移反應，在淀粉改性、制備大環糊精和功能成份的糖基化等方面具有重要應用價值。文中針對目前國內外關于4-α-糖基轉移酶的制備及應用研究進展進行了綜述。

4-α-糖基轉移酶，淀粉，改性，糖基化，應用，進展

4-α-糖基轉移酶(EC 2.4.1.25)是自然界存在的最為多樣性的一大類酶，屬于α-淀粉酶超級家族的第13組，是生物體內淀粉代謝過程中最重要的酶之一[1］。4-α-糖基轉移酶主要催化葡萄糖鏈在 α-葡聚糖分子中的轉移，完成轉糖基反應。這種轉糖基反應可以是催化葡萄糖鏈從一個α-葡聚糖分子轉移到另一個α-葡聚糖分子上，發生歧化反應，也可以催化α-葡聚糖分子內葡萄糖鏈的轉移，發生環化反應。除此之外，4-α-糖基轉移酶通常還顯示有淀粉水解酶活性，因此也可以被看成是一種多功能酶[2］。

近年來隨著生物技術的發展，4-α-糖基轉移酶的規模制備已成為可能，其在實際領域的應用潛力也越來越受到人們的關注。研究表明，4-α-糖基轉移酶應用于淀粉中，可以改變淀粉的分子結構、調整其鏈的長度、促成大環糊精的生成以及對淀粉主鏈具有緩慢適度降解等功能，從而達到對淀粉理化特性進行優化以及提高淀粉基食品品質的目的[3］。此外，4-α-糖基轉移酶的轉糖基作用還可用于制備糖基化功能產品，以提高原成分的功能特性[4］。

目前，國外尤其是歐美、日本和韓國，在4-α-糖基轉移酶特別是克隆的耐熱高轉移活性酶的高效制備及其對淀粉分子的改性等領域的應用研究已取得一定成果。國內對4-α糖基轉移酶的研究還處于起步階段，主要集中于酶基因的克隆與實驗室制備。因此，本文通過對國內外4-α-糖基轉移酶的制備及應用研究進展進行綜述，希望借此提高對這一新型食品改良劑的關注度，同時起到促進國內該酶制備及應用技術的研究開發。

14-α-糖基轉移酶的制備

4-α-糖基轉移酶廣泛分布在微生物和植物組織中，其中來源于微生物的4-α-糖基轉移酶被稱為麥芽糖轉葡糖基酶，而來源于植物的被稱為岐化酶或D-酶[5］。由于4-α-糖基轉移酶在原有微生物和植物體內的含量均很低，直接提取難以滿足研究和應用需求，所以其制備主要是通過將酶基因克隆到大腸桿菌等宿主細胞中并經過宿主細胞的過量表達來進行的[6］。

從20世紀90年代日本最早通過生物技術獲得高效表達4-α-糖基轉移酶的菌株開始，到目前為止，人們已經從多種微生物、植物中提取到該酶的基因并成功表達到宿主細胞中，獲得了催化功能略有差異的不同來源的4-α-糖基轉移酶產品[7-8］。而且由于嗜熱酶在工業中應用的諸多優勢，獲得該酶的耐熱類型一直是研究開發的重點。該過程主要涉及將極端耐熱菌中4-α-糖基轉移酶基因克隆至常溫宿主細胞進行過量表達，通過常溫發酵獲得大量耐熱酶產品。目前具有高轉移活性的耐熱酶的開發已取得很大的成功。

例如，Yoshinobu等將水生棲熱菌ATCC中的4-α-糖基轉移酶基因克隆在大腸桿菌中，成功得到高產耐熱4-α-糖基轉移酶的菌株，通過常溫發酵培養即可實現酶的大量制備，該酶最適溫度75℃，在80℃時仍保持催化活力的穩定[7］;Yoshihisa等將來源于超嗜熱古菌的4-α-糖基轉移酶基因(gtpK)在E.coli上過量表達，獲得的酶最適溫度達100℃，最適pH6-7，具有高糖基轉移活性[8］;另外，Hiromi等將嗜熱高溫球菌、海棲熱孢菌中的4-α-糖基轉移酶基因高水平表達在E.coli細胞中，也分別獲得了耐熱及高轉移酶活性4-α-糖基轉移酶的高產菌株[9-10］。

4-α-糖基轉移酶的高轉移酶活性和低水解酶活性，在實際領域特別是在淀粉工業中有其獨特的應用價值，但也存在只需要利用糖基轉移活性的情況。對此，Kazutoshi等采用易錯PCR(error-prone PCR)手段對棲熱菌4-α-糖基轉移酶基因進行突變，敲除編碼水解活性的片段，然后將此改造過的基因克隆到大腸桿菌中，獲得了幾乎完全喪失水解活性的耐熱轉移酶。這種酶作用于底物具有糖基轉移反應效率高、轉糖基化產物累積多的優勢[11］。此外，考慮到大腸桿菌可能存在的不安全性，Kang等還嘗試使用更為安全的枯草桿菌作為宿主細胞、利用雙啟動子手段來制備耐熱轉移酶，雖然獲得的菌株產酶率有所下降，但卻代表了耐熱4-α-糖基轉移酶的未來開發方向[12］。

在4-α-糖基轉移酶的制備領域，國內相關研究也取得了一定成果。例如，2007年王光水等將鏈霉菌糖基轉移酶基因MalQ插入原核表達載體pTrc-CKS中，以及將大腸桿菌MalQ基因插入原核表達載體pET-DsbA中，通過轉化大腸桿菌并輔以IPTG誘導，獲得了有效表達該酶的工程菌[13-14］。2008年劉佳歡等將水生棲熱菌4-α-糖基轉移酶基因轉化大腸桿菌，也獲得了成功表達[15］。

24-α-糖基轉移酶在淀粉工業上的應用

2.1 對淀粉的理化特性進行優化

正如前所述，4-α-糖基轉移酶具有歧化、環化和低水解活性的多功能催化機制，可以對天然淀粉分子結構進行改造從而優化淀粉的理化性質。通過離子色譜對酶處理前后的淀粉進行分析對比，結果已表明，4-α-糖基轉移酶可以使支鏈淀粉側鏈長度分布范圍變寬，低聚合度(DP1-8)的較短分支和高聚合度(DP＞19)的較長分支數量增加，同時輕度水解連接支鏈淀粉叢的主鏈，使淀粉分子量下降，并伴有少量不同聚合度環狀葡聚糖的生成[16］。4-α-糖基轉移酶對淀粉分子結構的這種改變，會導致淀粉糊化溫度降低、糊透明度提高，淀粉凝膠質構指標得到改善且不易發生老化[3］。

例如，將工程菌耐熱4-α-糖基轉移酶作用于大米淀粉，可以將大米淀粉中直鏈淀粉含量從30%降至23%左右，支鏈淀粉側鏈長度分布范圍變寬，特別是出現一些超長支鏈，使淀粉糊黏度下降、透明度上升，凝膠時間減短、最終的凝膠強度增加，且酶處理大米淀粉凝膠在4℃和70℃間顯示了良好的熱可逆性，凍融穩定性也大為提高[17-19］。進一步將耐熱 4-α-糖基轉移酶處理馬鈴薯淀粉和玉米淀粉，發現類似于大米淀粉的結構改變，改性后的淀粉糊化和凝膠溫度下降，熔點范圍變寬、結晶度降低，在濃度大于3%時凝膠表現很好的熱可逆特性，同時淀粉老化速度減緩[20-22］。但進一步研究也發現，4-α-糖基轉移酶對不同來源種類的淀粉，其改性效果還是存在差異，如對小麥淀粉、紅薯淀粉和豆類淀粉的凝膠特性的改變就并不顯著，這也說明該酶對淀粉分子的調整存在底物結構依賴性[23］。

此外，使用嗜熱4-α-糖基轉移酶改性糯米淀粉，再用嗜熱麥芽糖淀粉酶進一步處理，還可得到高分支化的支鏈淀粉簇，相比一般淀粉，支鏈淀粉簇具有更高的水溶解性和回生穩定性[24］。

2.2 用于大環糊精的制備

當淀粉底物含有較多直鏈淀粉時，4-α-糖基轉移酶傾向于環化催化反應機制。現有研究已表明，4-α-糖基轉移酶作用于直鏈淀粉可以導致聚合度(DP)為十幾至上百范圍的大環糊精的生成，且不同來源的4-α-糖基轉移酶其生成的大環糊精聚合度也不同[25］。例如，來源于馬鈴薯的 D-酶作用于直鏈淀粉，可以產生最小聚合度為17(CD17)的較寬范圍的大環糊精混合物，而且大環糊精產率與直鏈淀粉底物的分子量密切相關。當使用合適分子量范圍的直鏈淀粉底物，其大環糊精的產率可高達98%[5］。而酵母源的4-α-糖基轉移酶作用于直鏈淀粉，主要產生最小聚合度為11的相對低聚合度的大環糊精[26］。目前通過生物技術開發得到的一些耐熱、高轉移活性工程菌株，其耐熱酶轉化直鏈淀粉主要生成主要聚合度為22-50的大環糊精混合物。如水生棲熱菌4-α-糖基轉移酶(TSαGT)作用于馬鈴薯直鏈淀粉，控制合適的反應條件可以產生聚合度主要為23～26的大環糊精(圖1)，產率達到85%以上[25］。由于導致大環糊精產率低的主要原因是轉移酶的水解活性，日本學者將TSαGT基因中的水解基因剔除，用喪失水解酶活的新酶作用于直鏈淀粉，結果使大環糊精的產率幾乎提高到 100%[11］

大環糊精具有不同于常見小環糊精的獨有特性，諸如可包埋大分子化合物、在水中有很高的溶解性以及乳化特性等，預計在未來食品領域將是一種不可多得的新型綠色品質改良劑[27］。

2.3 用于糖原的制備

圖1 TSαGT作用于馬鈴薯直鏈淀粉所得大環糊精的MALDI-TOP-MASS圖

糖原的制備通常有兩種途徑，一是從動物的組織中直接提取，二是以1-磷酸葡萄糖為底物，通過α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的共同作用進行合成。而4-α-糖基轉移酶的開發利用為糖原的制備提供了第3條途徑。其過程是以淀粉為原料，先使用異淀粉酶將淀粉去分支為短鏈直鏈淀粉，然后利用4-α-糖基轉移酶的轉糖基作用將直鏈淀粉的短鏈適當延長，再利用淀粉分支酶的α-1，6-糖苷鍵的生成功能將適當長度的直鏈淀粉合成糖原。研究表明，該途徑是目前最有效的糖原制備方法，而且通過調整3種酶的作用條件，還可以將所得糖原的分子量控制在3.0×106-3.0×107[28］。

34-α-糖基轉移酶用于提高淀粉基食品的品質

淀粉是人們日常生活許多食品的主要基礎構成成分，如米飯、饅頭、面條和米糕等。因為這些食品大多數是在淀粉凝膠態下被食用，因此其中淀粉凝膠的質構特性也決定著食品的品質和口感。4-α-糖基轉移酶可以改善淀粉凝膠的特性，從而對于淀粉質食品品質的提高具有積極作用。

例如，米糕作為一種傳統小吃食品，是由糯米或大米米粉經混合、調味再經蒸制而制成的，其口感香甜滋潤，耐貯藏。米糕加工中遇到的最主要問題，就是貯存期間發生老化導致的食用品質的下降。在米糕加工過程中加入適量高轉移活性4-α-糖基轉移酶處理，發現米糕中直鏈淀粉含量從16.6%下降至12.7%，支鏈淀粉分子量顯著下降，側鏈長度分布范圍變寬，低聚麥芽糖含量增加。通過對米糕進行質構分析顯示，酶處理對米糕的硬度、膠著性和咀嚼性均有一定程度改善。利用DSC分析冷藏后米糕在40-60℃的熱焓△H，發現酶處理組△H比空白組低1.0 mJ/mg，這說明4-α-糖基轉移酶可顯著降低米糕在冷藏期間老化的發生[29］。

在面包加工過程中，適量4-α-糖基轉移酶的加入也可顯著提高面包的品質。因為酶的歧化反應及限量水解作用，一方面會導致面團體系中低聚麥芽糖含量增多、酵母發酵速度加快，更多CO2產生使面包體積顯著增加;另一方面，小麥淀粉凝膠特性的改善有效提高面包的口感質地;另外，由于直鏈淀粉含量的降低，酶處理面包在儲藏期間老化速率明顯減緩，更易被消費者接受。通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察也發現，酶處理面包的微觀結構顯示為更加規律而均勻的多孔網狀結構[30］。

此外，4-α-糖基轉移酶處理淀粉還可以作為脂肪替代物添加至蛋黃醬中，生產低脂蛋黃醬產品。有研究顯示，將4-α-糖基轉移酶處理后的大米淀粉制成15%的淀粉糊并輔以0.1%的黃原膠添加到蛋黃醬中，產品體系的動態流變學、粘度、穩定性、色澤及掃描電鏡結果與對照組非常相似，可替代蛋黃醬中50%的油脂而對產品的品質不造成不良影響[31］。

44-α-糖基轉移酶通過轉糖基反應用于功能成分的改性

4-α-糖基轉移酶具有切斷并重新生成α-1，4糖苷鍵的能力，從而實現糖基的轉移。而且該酶表現為對于α-1，4糖苷鍵的專一性，而對于受體專一性不強。受體不僅可以是單糖、雙糖或低聚麥芽糖，還可以是糖醇、異黃酮或抗壞血酸等。許多具有生理功能的分子可以通過4-α-糖基轉移酶的轉糖基反應進行改性，使理化性質得到進一步提高。

4.1 異黃酮類功能成分的糖基化改性

異黃酮屬于酚類化合物，是植物的次生代謝產物，具有抗氧化、抗癌和預防心血管疾病等諸多功能。植物異黃酮主要以游離苷元和糖苷兩種形式存在，目前得到廣泛開發與應用的主要有大豆異黃酮、葛根素、染料木素等以及它們的葡萄糖苷，但這些化合物通常水溶性較低，實際應用受到限制。研究表明，異黃酮糖苷的親水性與糖基的數目有直接相關性，隨著糖基的增多、苷元所占比例變小，相應其親水性也會增大[26］。通過向異黃酮糖苷進行轉糖基反應，就可使這些水不溶物變成水溶性物質[32］。

例如，染料木苷是大豆異黃酮的主要成分，水生棲熱菌4-α-糖基轉移酶能夠以可溶性淀粉為供體、將淀粉中的葡萄糖鏈轉移到染料木苷的葡糖基上，形成帶有1～22個葡聚糖的染料木苷混合物，進一步利用β-麥芽糖酶水解葡聚糖鏈，可得到比原有結構多一個葡萄糖或麥芽糖分子的染料木苷糖衍生物。溶解度測定結果表明，染料木苷在水中溶解度為0.023mmol/L，而染料木苷葡萄糖和麥芽糖衍生物的溶解度分別達到 83.7 mmol/L 和 1013.4 mmol/L[32］。進一步的生物活性研究表明，染料木苷糖衍生物具有與染料木苷同樣的對金屬硫蛋白基因和6-磷酸脫氫酶基因轉錄的調控作用，還原能力甚至還略微增強[33］。同樣，利用4-α-糖基轉移酶還可以制備葛根素的糖基衍生物，其水溶性可增加100倍以上。通過還原力分析、超氧化物歧化酶活力分析和羥自由基清除活性分析等表明，葛根素糖基衍生物擁有葛根素同樣的抗氧化能力，兩者均能有效降低機體低密度脂蛋白的氧化，顯示出很好的保健功能[34-35］。

4.2 甜菊甙的糖基化改性

甜菊糖是一種天然的甜味劑，是從甜葉菊葉子中提取的八種雙萜糖苷的混合物，其中甜菊苷、甜菊雙糖A苷、甜菊雙糖C苷的含量占到90%以上。甜菊糖中的甜菊苷和甜菊雙糖C苷約占80%，有一定的苦味，嚴重影響甜葉菊糖的味質。為此，利用糖基化反應對甜菊苷結構進行改造，可有效改善甜菊糖的甜味特征。

例如，以玉米淀粉或環糊精為供體，利用環糊精糖基轉移酶的4-α-轉糖基作用可以獲得葡萄糖基和麥芽糖基甜菊糖，產物中兩者的比例分別為66%和24%，轉化率接近100%[36］。經糖基化改性后的甜菊糖其不良甜質得到有效改善。

4.3 抗壞血酸的糖基化改性

抗壞血酸的性質很不穩定，容易被熱和或氧化劑破壞，其貯存和應用都受到很大限制。利用4-α-轉糖基作用，可以將淀粉、麥芽糊精或環糊精供體中的葡糖基團接入L-抗壞血酸的C2位，經葡萄糖淀粉酶的水解后形成2-O-α-D-葡萄糖-L-抗壞血酸，轉化產率達到60%[37］。最近報道有利用分子篩作吸附劑、褐藻酸鈉-氯化鈣體系作載體以及戊二醛作交聯劑制備固定化環糊精糖基轉移酶，以β-環糊精為供體，連續進行抗壞血酸的糖基化反應，最后反應體系中抗壞血酸糖苷的含量達到21g/L，產率是游離酶反應的2倍，為酶法連續化生產抗壞血酸糖苷提供了一條可行的途徑[38］。

抗壞血酸糖苷具有體外性質穩定、體內抗氧化活性高的特點，不僅可應用于食品中，應用于在化妝品中還具有美白、促進膠原蛋白生成等多種功效。

5 存在問題與展望

圖2 L-抗壞血酸(a)和2-O-α-D-葡萄糖-L-抗壞血酸(b)的化學結構

到目前為止，通過對高轉移活性4-α-糖基轉移酶基因的轉化及高效表達，基本可以實現該酶的規模制備，但存在的問題是，至今人們對4-α-糖基轉移酶的多功能催化機制仍未完全明了，從而也影響了該酶在實際領域的深入應用。

如前所述，4-α-糖基轉移酶主要具有歧化和環化兩種轉移酶活性，由于這兩種催化活性對淀粉分子的改造方式不同，所得改性淀粉的性質也不同。歧化反應更利于凝膠的形成而環化反應使糊透明度、凍融穩定性及抗老化性更好。兩種催化活性具有底物結構依賴性。不同來源的淀粉由于其結構不同，酶對其進行歧化或環化作用的選擇及反應程度也不同，導致酶改性后的淀粉結構變化趨勢及相應凝膠特性存在較大差異。因此，找出歧化和環化的發生與底物結構間的對應關系，是今后4-α-糖基轉移酶研究領域亟需解決的問題。

對此，將來的研究可以嘗試使用明確組成及結構的系列淀粉底物，如使用不同直鏈淀粉含量的混合淀粉、不同聚合度的直鏈淀粉以及不同聚合度的支鏈淀粉等作為底物，對該類酶對淀粉的雙催化特性及規律進行系統研究，了解其不同催化方式對淀粉分子結構的要求。通過對4-α-糖基轉移酶的多功能催化機制的闡明，不但可以達到對原有淀粉分子結構進行一定的優化改造，還可以人為控制酶的歧化和環化反應進程，從而實現制備具有特定功能特性的酶改性淀粉產品。

相信隨著4-α糖基轉移酶技術的快速進步與提高，不久的將來，4-α糖基轉移酶必將稱為一種新型的綠色食品改良劑在食品工業中得到廣泛的應用。

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ABSTRACT4-α-glucanotransferases(EC 2.4.1.25)can catalyze the intermolecular or intramolecular transglycosylation of malto-oligosaccharides and have perspective applications in modification of starches，production of largering cyclodextrins and transglycosylation of some functional ingredients.This paper reviews the production of 4-α-glucanotransferases and their promising applications in food industry.

Key words4-α-glucanotransferases，starch，modification，transglycosylation，application，advance

Research Advances on 4-α-glucanotransferases and Their Applications

Li Xue-hong，Wang Bing，Lu Yong，Zhang Yong
(College of Food and Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzgou 450002，China)

博士，副教授。

*國家自然科學基金資助項目(31171757);鄭州輕工業學院博士啟動基金項目(2007BSJJ004);2011年鄭州市科技創新團隊項目

2011-12-27