活性污泥中1株產PHB絲狀細菌的分離與鑒定*

馬忠友，汪建飛，祝嫦巍，吳萍

1(安徽科技學院，生命科學學院，安徽 鳳陽，233100)

2(安徽科技學院，城建與環境學院，安徽 鳳陽，233100)

活性污泥中1株產PHB絲狀細菌的分離與鑒定*

馬忠友1，汪建飛2，祝嫦巍1，吳萍1

1(安徽科技學院，生命科學學院，安徽 鳳陽，233100)

2(安徽科技學院，城建與環境學院，安徽 鳳陽，233100)

從污水處理廠等活性污泥樣品中分離到了19株絲狀細菌，通過蘇丹黑染色法和紫外吸收光譜掃描技術證明這些絲狀細菌能夠在菌體內積累聚β-羥基丁酸(PHB)。采用氯仿乙醇法提取PHB，并采用紫外吸收法進行定量測定，篩選出1株高產PHB絲狀細菌HY10，細胞PHB含量為(37.24±0.74)%，PHB產量為1.15±0.06 g/L。綜合該菌株的菌落形態和16S rDNA序列(GenBank No.JQ353768)分析結果將HY10菌株鑒定為假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)。

聚β-羥基丁酸，絲狀細菌，假蕈狀芽孢桿菌

隨著塑料制品的廣泛使用，廢棄的化學塑料由于不能被微生物分解，帶來了嚴重的“白色污染”。聚β-羥基丁酸(PHB)是細菌細胞內積累的一種能被微生物酶所降解的高分子聚合物。PHB的性質與目前普遍使用的合成塑料有許多相似之處，例如可壓塑、成膜和拉絲等，此外，它還具有生物可降解性和生物相容性等優點，在醫學尤其在組織工程上，具有重要的作用。因此，PHB作為一種新型的塑料替代品以及生物醫學材料，已經成為人們的研究熱點[1］。Lemoigne于1926年首先在巨大芽孢桿菌(Baillus megatheriucm)細胞中發現PHB，能產生PHB的微生物分布極廣，包括光能和化能自養及異養菌，共65個屬中的近300種微生物。目前研究得較多用于合成PHB的微生物有:產堿桿菌屬(Alcaligenes)，假單胞菌屬(Pseudonomas)，甲基營養菌(Methylotrophs)，固氮菌屬(Azotobacter)和紅螺菌屬(Rhodospirillum)等，它們能分別利用不同的碳源合成不同的PHAs。其中以真養產堿桿菌的研究最多，也最成熟，已經能夠小規模工業化生產 PHB 和 PHBV[1-2］。

絲狀細菌主要分布在水生環境、潮濕土壤和活性污泥中，該類細菌能在胞內積累含量較高的PHB顆粒，而且它們對污水中的有機物和有毒物質有很強的降解能力，在污水處理過程中發揮著重要的作用[3］。如果能以工廠污水為原料，利用絲狀細菌來生產PHB，一方面將有可能大大降低PHB的生產成本，另一方面又使污泥得到了合理利用。本研究采用低營養培養基，通過富集培養和紫外吸收光譜測定技術，從活性污泥中分離、篩選到了1株高產PHB絲狀細菌，并通過16S rDNA測序技術對該菌株進行了分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源

蚌埠市第一污水處理廠活性污泥、安徽科技學院校內排水溝污泥、鳳陽城區居民排水溝污泥和面粉廠排污處污泥。

1.1.2 實驗藥品

聚 β-羥基丁酸標準品(美國，Sigma-aldrich)，其他實驗藥品均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基

尿素富集培養基(g/L):尿素0.5，葡萄糖1.0，MgSO4·7H2O 0.05，K2HPO40.1，自來水定容至1L，pH 7.0～7.2，115℃滅菌30 min。

Stoke分離純化培養基(g/L):葡萄糖1.0，蛋白胨1.0，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.05，FeCl30.01，自來水定容至1L，pH 7.0～7.2，瓊脂20，115℃滅菌30 min[3］。

產PHB基礎發酵培養基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨 3，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.05，FeCl30.01，K2HPO40.04，KH2PO40.03，NaH2PO4·2H2O 0.05，H3BO30.005，蒸餾水定容至1L，pH 7.0，分裝至250mL三角瓶中，每瓶50mL，115℃滅菌30 min。

1.2.2 顯微染色觀察

按常規制成涂片，以0.3%蘇丹黑 B染色10 min，水沖去染劑，用濾紙吸將水吸干，再用二甲苯沖洗至無色素，然后用0.5%番紅復染1 min，水洗，吸干，鏡檢。PHB顆粒染成黑綠色，菌體其他部分呈紅色[4］。

1.2.3 產PHB絲狀細菌的分離、純化

取活性污泥5 g接種于100 mL已滅菌的富集培養液(尿素培養基)中，30℃搖床培養1天，再靜止培養1天。待長出漂浮于液體中的半透明絮狀物時，挑取絮狀物，經蘇丹黑染色顯微鏡鏡檢有PHB顆粒后，再挑取絮狀物移入新鮮富集培養基中繼續培養。

挑取少量經過多次富集后得到的絮狀物，在Stoke平板上劃線分離，30℃培養2天，見有絲狀體伸展時，挑取絮狀物，經蘇丹黑染色顯微鏡鏡檢有PHB顆粒后，及時用接種針挑取菌體在Stoke平板上劃線。經過3～4次的重復劃線后，既可得純菌落。

1.2.4 PHB的紫外吸收光譜掃描定性分析

準確稱取0.01 g干菌體，放入干凈的帶刻度的試管中，加入20 mL V(三氯甲烷)∶V(乙醇)=2∶1，溶液，于60℃的水浴鍋內水浴抽提1 h，接著過濾，取濾液0.2 mL加入另一批干凈的試管中，放入干燥箱內蒸發掉氯仿和乙醇，然后加入10 mL濃H2SO4，100℃中水浴10 min，冷卻并混勻，在200～800 nm范圍內進行掃描檢測[3］。

1.2.5 PHB定量標準曲線的制備

PHB在濃H2SO4中加熱時可以定量地轉化為巴豆酸(反-2-丁烯酸)。根據巴豆酸在235 nm處有一最大吸收峰值，而其它含碳化合物在同樣條件下的吸收峰與PHB有很大的差別，建立適用于PHB含量測定的PHB標準曲線。

用電子天平準確稱取0.01 g PHB標準品，加入20 mL三氯甲烷，混勻，于60℃水浴30 min，使其充分溶解，PHB濃度為500 μg/mL。從中吸取2 mL，加入198 mL氯仿，混勻溶解，PHB 濃度為5μg/mL，再從該溶液中分別吸取 1，2，3，4，5，6，7 mL 加入 7 支干燥的帶塞帶刻度的干凈試管中(每個濃度各3支)，使其中 PHB 的質量分別為 5，10，15，20，25，30，35 μg。加熱除去三氯甲烷，加入10 mL濃H2SO4，試管口用玻璃片蓋住，在100℃水浴中加熱10 min，冷卻，并充分混勻。然后用濃H2SO4作空白對照，在紫外可見分光光度計的235 nm處測OD值。以PHB濃度為橫坐標，OD值為縱坐標作圖，即可得到PHB濃度標準曲線[5］，如圖1 所示。

圖1 PHB的標準曲線

1.2.6 產PHB絲狀細菌的篩選

將獲得的產PHB絲狀細菌接種于液體基礎發酵培養基中，每株設置3個重復。30℃進行搖瓶培養2天，8000 r/min離心發酵液，棄去上清液，洗滌沉淀物，得濕菌體于60～70℃下烘干。稱細胞干重，測PHB的含量，計算各菌株PHB的產量，篩選出高產PHB的菌株。

1.2.7 PHB含量的測定

采用氯仿乙醇法提取菌體胞內的PHB，經濃硫酸處理后，用紫外可見分光光度計在235 nm處測OD值，并通過PHB定量標準曲線計算其含量及產量[3］。

1.2.8 產PHB細菌的分類鑒定

菌株16S rDNA區域的擴增采用菌液PCR法，擴增引物采用27F(5'– AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3')和 1492R(5'– GGTTACCTTGTTACGACTT –3')。

表1 PCR擴增體系

擴增反應在美國Bio-Rad公司生產的PCR儀上進行。

擴增程序:94℃變性5 min，(94℃變性1min，52℃退火1 min，72℃延伸1min)×30，72℃延伸 10 min，4℃保溫。取5 μL PCR產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。PCR擴增產物被送到上海Invitrogen生物技術有限公司進行測序。

1.2.9 系統樹的構建

為研究供試菌株與已知細菌的親緣關系及其系統地位，在GenBank上下載相關近緣種細菌菌株的16S rDNA區域序列與供試菌株的序列放在一起，用BioEdit軟件進行匹配排列，使用MEGA4.1軟件，并采用Neighbor-Joining方法構建分支系統樹和Bootstrap analysis方法進行1000次重復抽樣分析。

2 結果與分析

2.1 產PHB絲狀細菌的分離

從不同地點采集到的污泥樣品，經過三角瓶富集培養，結合平板劃線和蘇丹黑染色顯微鏡檢法，成功分離到了19株產PHB絲狀細菌。結果表明，蚌埠市第一污水處理廠活性污泥、本校排水溝污泥、鳳陽城區居民排水溝污泥、鳳陽郊區面粉廠排污處污泥均分離到了絲狀細菌。不同地點的污泥樣品中所含產PHB絲狀細菌的數量不同，其中以蚌埠市第一污水處理廠活性污泥最多，共分離到10株。絲狀細菌HY10菌株的菌落和胞內積累的PHB顆粒如圖2所示。

圖2 絲狀細菌HY10

2.2 PHB的紫外光譜掃描定性分析

采用氯仿乙醇法提取菌體胞內物質，將所獲得的白色粉末或薄膜狀樣品經濃硫酸處理后，在200～800 nm利用島津UV-2550紫外分光光度計進行掃描檢測，并以濃H2SO4做空白對照。實驗結果表明，濃H2SO4處理產物在235 nm處有一最大吸收峰值(圖3)，這與PHB標準品在熱濃硫酸中的轉化產物——巴豆酸(反-2-丁烯酸)的最大吸收值一致。

圖3 PHB的紫外掃描光譜圖

2.3 產PHB絲狀細菌的篩選

將分離純化得到的19株產PHB絲狀細菌接入基礎發酵培養基中，30℃搖床培養2天，實驗結果見表1。經比較，編號為HY10的菌株細胞干重為3.08±0.12 g/L，PHB含量為(37.24±0.74)%，PHB產量為1.15±0.06 g/L，PHB的含量和濃度均為最高，而細胞干重也較高，故選擇HY10菌株作為進一步研究的菌株。

表1 不同絲狀細菌PHB產量的比較

2.4 產PHB絲狀細菌的分類鑒定

采用菌液PCR法擴增HY10菌株的16S rDNA序列，取5 μL PCR產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，如圖4所示，長度約1500 bp。

圖4 HY10菌株16S rDNA序列PCR產物的電泳圖譜

根據HY10菌株的16S rDNA序列(GenBank No.JQ353768)在GenBank數據庫中進行同源序列搜索(BLAST search)，結果顯示HY10菌株和假蕈狀芽孢桿菌Bacillus pseudomycoides NBRC 101232(Gen-Bank No.AB681414)、B.pseudomycoides DSM 12442(GenBank No.AM747226)的16S rDNA區序列完全相同，相似性為100%。從GenBank數據庫中下載相關菌株蠟狀芽孢桿菌B.cereus IAM 12605T(GenBank No.D16266)、巨大芽孢桿菌 B.megaterium IAM 13418T(GenBank No.D16273)、蕈狀芽孢桿菌 B.mycoides DSM 2048T(GenBank No.X55061)、B.mycoides DSM 2048T(GenBank No.AB592538)、枯草芽孢 桿 菌 B.subtilis NCDO 1769T(GenBank No.X60646)、假蕈狀芽孢桿菌 B.pseudomycoides NBRC 101232(GenBank No.AB681414)、B.pseudomycoides DSM 12442(GenBank No.AM747226)、B.pseudomycoides GTC 02831(GenBank No.AB592542)、B.pseudomycoides NRRL B-617T(GenBank No.AF013121)和大腸桿菌Escherichia coli ATCC 11775T(GenBank No.X80725)的16S rDNA序列構建系統發育樹(圖5)，HY10菌株和假蕈狀芽孢桿菌 B.pseudomycoides聚在一組，概率99%。因此綜合HY10菌株的形態特征(圖1)和16S rDNA序列，把該菌株鑒定為假蕈狀芽孢桿菌Bacillus pseudomycoides Nakamura[6］。

3 討論

圖5 芽孢桿菌屬部分菌株的16S rDNA序列分支系統樹

絲狀細菌的比表面積大，有利于攝取低濃度底物，在底物濃度相對較低的條件下比其他細菌增殖速度快。根據這個特點，很多絲狀細菌被從樣品中分離出來，如浮游球衣菌 Sphaerotilus natans[7，8］和蕈狀芽孢桿菌B.mycoides[9］等。本研究從不同來源的活性污泥中分離到了19株產PHB絲狀細菌，由于所在的環境條件不同，其積累PHB的能力也不同。從污水處理廠活性污泥分離到的假蕈狀芽孢桿菌B.pseudomycoides HY10菌株的生長能力和PHB產量最高，這可能與污水處理廠常年處理不穩定的不同性質的污水有關，因為PHB在環境壓力和營養不平衡的條件下更容易被微生物合成[10］。

通過核磁共振波譜技術研究顯示，生物可降解塑料聚羥基脂肪酸酯有聚β-羥基丁酸(簡稱PHB)、聚β-羥基戊酸(簡稱 PHV)和聚 β-羥基己酸(簡稱PHH)等多種類型[4，11-15］，此外，在一定條件下2種或2種以上的單體還能形成共聚物，其典型代表是3HB和3HV組成的共聚物P(3HB-co-3HV)，又寫成PHBV[10，16］。在培養基中加入不同的單體(例如:3-羥基戊酸鹽，3-羥基丁酸鹽，3-羥基己酸鹽等)，進行多樣性的組合，改變其性能，可以產生巨大的高分子生物聚合物。從圖3中可以看出除了在235 nm處有一最大吸收峰，PHB標準品在303 nm處有一較弱的吸收峰，而假蕈狀芽孢桿菌HY10胞內PHB在319 nm處有一較弱的吸收峰，說明假蕈狀芽孢桿菌HY10胞內PHB的單體和3-羥基丁酸有差異，可能具有新的基團，有待于利用紅外光譜和核磁共振技術進一步研究。

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ABSTRACT19 strains of filamentous bacteria that accumulated poly-β-hydroxybutyrate(PHB)were isolated from activated sludge by enrichment cultivation.Staining with Sudan Black B was applied to detect PHAs.Quantitative estimation of PHB extracted from the isolates was done by Ultraviolet spectrophotometer method.PHB was extracted from these strains through the CHCl3-CH3CH2OH method.The PHA productivities of strain HY10 was the highest in 19 isolates mentioned above，in which PHB yield and productivities were(37.24 ±0.74)%dry cell weight(DCW)and 1.15±0.06 g/L，respectively when grown in a medium containing 20 g/L sucrose.According to its clone morphological and the 16S rDNA sequence(GenBank No.JQ353768)，it suggested that strain HY10 was Bacillus pseudomycoides.

Key wordspoly-β-hydroxybutyrate，filamentous bacteria，Bacillus pseudomycoides

Isolation and Characterization of Filamentous Bacteria HY10 Accumulating Poly-β-hydroxybutyrate(PHB)from Activated Sludge

Ma Zhang-you1，Wang Jian-fei2，Zhu Chang-wei1，Wu Ping1
1(College of life Science，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China)
2(College of Urban Construction ＆ Enviroment Science，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China)

博士，講師(汪建飛教授為通訊作者)。

*國家自然科學基金(31100070);安徽科技學院穩定人才基金(2RC2011299);安徽科技學院生物學重點建設學科(AKXK20102-1);安徽農業科技成果轉化基金(10140306017)

2012-01-07，改回日期:2012-02-02