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提高芝麻粕飼用品質的發酵菌種篩選與發酵條件優化*

2012-09-12 13:20:10彭惠惠徐雅芫李呂木錢坤吳東周芬許發芝丁小玲
食品與發酵工業 2012年5期
關鍵詞:影響

彭惠惠,徐雅芫,李呂木,,錢坤,吳東,周芬,許發芝,丁小玲

1(安徽農業大學 茶與食品科技學院,安徽合肥,230036)

2(安徽農業大學 生命科學學院,安徽 合肥,230036)

3(安徽農業大學動物科技學院,安徽合肥,230036)

4(安徽省畜牧生物工程技術研究中心,安徽 合肥,230031)

提高芝麻粕飼用品質的發酵菌種篩選與發酵條件優化*

彭惠惠1,徐雅芫2,李呂木1,3,錢坤4,吳東4,周芬4,許發芝3,丁小玲3

1(安徽農業大學 茶與食品科技學院,安徽合肥,230036)

2(安徽農業大學 生命科學學院,安徽 合肥,230036)

3(安徽農業大學動物科技學院,安徽合肥,230036)

4(安徽省畜牧生物工程技術研究中心,安徽 合肥,230031)

以普通芝麻粕為原料,選用枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌多個菌種,通過單因素、正交試驗,優化微生物發酵條件,以降低芝麻粕中植酸含量,提高粗蛋白、酸溶蛋白等有益成分的含量。單因素試驗的優化條件為:料水比1∶0.8(g∶mL)、R-02與KG-109混菌發酵;正交試驗優化的發酵條件為:溫度30℃、R-02與KG-109接種比例2∶1、接種量8%、時間10d。在此條件下發酵后植酸含量為0.08%,植酸降解率達到86.21%,粗蛋白含量為49.85%,酸溶蛋白為9.07%,揮發性鹽基氮為2075.5 mg/kg。

芝麻粕,植酸,固態發酵,優化

中國是芝麻的主產區,根據國家統計信息,2008年芝麻總產量達到58.6萬t。每年約有50%的芝麻用于榨油,剩余芝麻餅粕約14.7萬t。芝麻餅粕的營養豐富,氨基酸組合全面,但含有大量植酸和單寧[1],直接飼喂影響動物的適口性,降低礦物質離子的吸收率和飼料的消化率,這些都限制了芝麻餅粕在畜禽日糧中的廣泛應用。降低芝麻餅粕中植酸含量的手段很多,如高溫蒸煮[2]、高壓、溶劑法、超濾法[3]等,但這些方法存在成本太高,其他營養成分被破壞等問題。因此,人們開始關注條件溫和的生物學方法,即酶制劑法和微生物發酵法。酶制劑法使用方便、效果顯著、作用條件溫和[4],但單種酶系效果單一[5];然而微生物發酵法利用微生物生長迅速,數量多、酶系復雜等特點,操作簡單,去除抗營養因子效果明顯,還能增加小肽等有益成分[6]。Ramachandran等人[7],用微生物固態發酵椰子餅粕和芝麻餅粕,經條件優化,植酸酶產量達到64 U/g。Singh等人[8]用嗜熱孢霉菌固態發酵芝麻餅粕,植酸酶活力達到282 U/g(干基),能夠有效降低植酸含量。以上研究對植酸去除雖有一定的效果,但都是利用好氧菌進行有氧發酵,有氧發酵較厭氧發酵將消耗大量營養物質產能,同時中間代謝產物也被徹底氧化而損失。利用厭氧或兼性厭氧微生物進行的厭氧發酵,在豆粕[9]、菜籽粕[10]等方面都有相關報道。本課題以普通芝麻粕為原料,以植酸含量為主要考察指標,篩選合適的微生物,優化微生物厭氧發酵條件,同時研究粗蛋白、酸溶蛋白等有益成分的含量,以及揮發性鹽基氮等有害成分的含量,旨在降解芝麻粕中的植酸和提高發酵芝麻粕產品的飼用品質,為大規模生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

為安徽農業大學飼料科技研究所保藏的乳酸菌(Laobacillus)-01(R-01)、乳酸菌-02(R-02)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)-109(KG-109)、酵母菌(Saccharomyces)-05(J-05)、酵母菌-06(J-06)、酵母菌-08(J-08)、酵母菌-10(J-10)、酵母菌-11(J-11)。

1.1.2 原料

芝麻粕:水分含量9.59%,粗蛋白含量43.85%,總磷含量1.40%,植酸含量0.59%,原料粉碎過40目篩備用。

1.1.3 化學試劑

濃 H2SO4、三氯乙酸(TCA)、FeCl3。

1.1.4 培養基

LB 培養基:蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、吐溫 2010 mL、蒸餾水1000 mL,pH 7.0,121℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培養基:蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、NaCl5g、蒸餾水1000 mL,pH 7.2,121℃ 滅菌 20 min。

MRS培養基:蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母膏5 g、K2HPO42 g、檸檬酸銨2g、乙酸鈉5g、葡萄糖 20g、吐溫805mL、MnSO40.25 g、MgSO40.58 g、蒸餾水1000 mL,pH 7.0,115℃滅菌 30 min。

1.1.5 儀器設備

凱氏定氮儀,上海沛歐分析儀器有限公司;HC-2518高速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;752紫外可見分光光度計,上海浦東物理光學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化

將凍藏菌種接種于50 mL液體完全培養基上,室溫培養。乳酸菌:MRS培養基,37℃,靜置培養24h;枯草芽孢桿菌:牛肉膏蛋白胨培養基上培養,37℃,160 r/min振蕩培養24 h;酵母菌:LB培養基,30℃,120 r/min振蕩培養48 h。

1.2.2 發酵種子液的制備

取活化的菌液,以2%的接種量分別接到各菌的完全培養基中,以室溫培養制成發酵種子液。

1.2.3 固態發酵

將芝麻粕、玉米漿、菌液及水,攪拌均勻后,裝入密封袋,排出空氣并封口。28℃培養,發酵7、14 d分別取樣,65℃烘干粉碎,測定樣品的植酸、酸溶蛋白、粗蛋白、揮發性鹽基氮含量。

1.2.4 不同菌種對芝麻粕發酵效果的影響

按照1.2.3的方法進行單因素試驗。將R-01、R-02、J-05、J-6、J-8、J-10、J-11 七株菌,按料水比為1∶1.2(g∶mL)分別進行單菌固態發酵,培養基成分均為芝麻粕96%、玉米漿10%、菌液6%、水108%(總計220%)。

1.2.5 不同料水比對芝麻粕發酵效果的影響

將單菌試驗中篩選出的R-02與好氧枯草芽孢桿菌KG-109混合發酵,按表1中培養基成分進行發酵。挑選對植酸降解率最高的料水比進行以后的混菌發酵試驗。

表1 料水比試驗培養基成分表

1.2.6 不同菌種組合對芝麻粕發酵效果的影響

在已選出的單菌基礎上,根據乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌需氧不同的特點,好氧菌可以消耗發酵培養基中的氧氣,為后期發酵提供厭氧環境,故將好氧型枯草芽孢桿菌分別與厭氧型乳酸菌、兼性厭氧型酵母菌搭配,分為(R-02+KG-109)、(J-11+KG-109)兩個組合,按料水比(g∶mL)為1∶0.8、菌液比例為1∶1進行發酵試驗,培養基成分為芝麻粕96%、玉米漿10%、菌液6%、水68%(總計180%)。篩選降解植酸最優的一個組合菌。

1.2.7 芝麻粕發酵條件正交優化

對所篩選的菌株組合進行條件優化,根據單因素試驗結果,確定料水比為1∶0.8(g∶mL)。采用 L9(34)正交試驗設計對芝麻粕厭氧發酵的發酵條件溫度、接種比例、接種量以及發酵時間進行優化,正交試驗因素水平見表2。以降低芝麻粕的植酸含量為目標確定厭氧發酵條件的最佳組合,同時測定各處理組合的粗蛋白、酸溶蛋白以及揮發性鹽基氮含量。

表2 厭氧發酵試驗正交設計的因素水平表

1.3 指標測定方法

植酸的測定方法為TCA法[11],粗蛋白的測定方法為凱氏定氮法,酸溶蛋白的測定方法為三氯乙酸法[12],揮發性鹽基氮的測定方法為半微量定氮法[13]。

1.4 數據統計與分析

試驗數據以X±SD表示,采用SAS9.0軟件中的glm和anova語句進行方差分析,并用鄧肯新復極差法進行顯著性多重比較。

2 結果與討論

2.1 不同菌種對芝麻粕發酵效果的影響

在選擇的菌種中,以植酸降解效果為主要目標,并考慮其降解大分子蛋白為酸溶性蛋白的能力,結合發酵后粗蛋白含量和揮發性鹽基氮含量,篩選出能夠較好降解芝麻粕中植酸的單株菌以進行下步試驗。

由表3可知,J-11發酵樣的植酸含量最低,降解率達到53.14%,顯著優于其他6株菌(P<0.05);菌株在生長穩定期產生的植酸酶最多,降解效果明顯,隨著菌株的衰亡,植酸酶產量降低,植酸降解速度也會減緩,所以發酵14 d樣與7 d樣差別不顯著,這與Roopesh等人[14]研究菌發酵條件優化的結果一致,可能是菌體生長階段不產植酸酶。這一結果表明,單菌發酵7 d就可以達到其降解植酸的最大效果。

粗蛋白含量變化結果表明,R-01和R-02兩株乳酸菌較優,發酵后粗蛋白含量均高于發酵前芝麻粕的粗蛋白含量。固態厭氧發酵時其物質是守恒的[15],隨著發酵的進行,培養基中的物質被微生物分解,部分轉化為氣態(實驗時厭氧發酵袋有脹氣現象),由于總基數減少,造成粗蛋白含量升高[16]。能量消耗的快速階段主要在發酵的最初7d,以后趨于穩定,因此R-01和R-02單菌發酵7d即可達到較高的粗蛋白水平。酸溶蛋白含量也是R-01和R-02兩株乳酸菌較優,可能是由于乳酸菌能夠分泌較多的蛋白酶,將大分子蛋白質分解為小分子多肽和氨基酸。而揮發性鹽基氮產量則是J-06和 J-11兩株酵母菌較低,可能是由于這兩株菌分泌的蛋白酶較少,蛋白質被分解產生氨及胺類物質較少[17]。但各菌14天的揮發性鹽基氮產量均高于7天(P<0.05),表明隨著時間的延長,微生物分解蛋白質活動延長,揮發性鹽基氮含量增加。

R-01與R-02兩菌發酵的植酸含量、粗蛋白含量、酸溶蛋白含量和揮發性鹽基氮含量指標差異均不顯著(P>0.05),但在相同的培養條件下R-01種子液培養時間比R-02長;因此,綜合考慮,選取植酸和揮發性鹽基氮含量最低的J-11以及粗蛋白和酸溶蛋白含量最高的R-02進行下步混菌試驗。

R-01與R-02兩菌發酵的植酸含量、粗蛋白含量、酸溶蛋白含量和揮發性鹽基氮含量指標差異均不顯著,但在相同的培養條件下R-01種子液培養時間比R-02長;因此,綜合考慮,選取J-11和R-02進行下步混菌試驗。

表3 不同菌株對發酵結果的影響

2.2 不同料水比對芝麻粕發酵效果的影響

固態厭氧發酵中水分對發酵效果影響很大[18],水分含量高會使基質的松散程度及含氧量降低,有利于厭氧菌的生長,對好氧菌不利,水分含量過高對飼料后期生產工藝會造成極大的影響。不同料水比試驗結果如表4所示。可見,發酵7 d時料水比(g∶mL)1∶0.8、1∶1 植酸含量較低,說明水含量過多,會影響微生物分解植酸[19]。料水比為1∶0.6時植酸含量與料水比1∶0.8、1∶1 差異不顯著(P >0.05),但由于水含量較低,氧氣充足,造成霉菌等雜菌在發酵培養基中生長,影響發酵芝麻粕的飼用品質,因此,水分含量也不宜過低。

發酵7d料水比1∶1、1∶1.2粗蛋白含量較高;發酵14 d 料水比1∶0.6、1∶1、1∶1.2 較優,可能是水分含量高有助于厭氧菌R-02的快速生長,消耗較多的營養物質,而水分較低時氧氣含量較高,好氧菌KG-109先消耗掉大部分氧氣后,厭氧菌才能大量生長,消耗較多的營養物質。料水比1∶1的酸溶蛋白含量均較高,可能是料水比1∶1時微生物產蛋白酶的量較多;料水比1∶0.6、1∶0.8時的揮發性鹽基氮含量顯著低于其他組,但水分過低霉菌等雜菌易生長,故料水比1∶0.8在實際試驗中優于料水比1∶0.6;隨著發酵時間延長,微生物生長,蛋白酶增多,發酵14 d的揮發性鹽基氮含量顯著優于7 d,因此料水比1∶0.8時發酵7 d可以有效降低揮發性鹽基氮含量。

料水比1∶1條件下發酵后樣品中粗蛋白和酸溶蛋白含量較高,但與料水比1∶0.8差異不顯著(P>0.05),且料水比為1∶1時揮發先鹽基氮含量顯著高于料水比1∶0.8,能夠被動物消化吸收的蛋白質含量不高;其次根據飼料加工工藝,含水量較低能夠節約能源,故1∶0.8 優于1∶1,選取料水比1∶0.8 作為固態發酵的最優水平。

從發酵時間來看,欲取得較好的植酸降解效果和產生更多的酸溶蛋白,以14天為好,但揮發性鹽基氮的量卻是時間越長含量越高,也即蛋白質損失越多。這兩方面是矛盾的,實際生產中有必要在兩方面之間進行權衡。

表4 料水比對發酵結果的影響

2.3 不同菌種組合對芝麻粕發酵效果的影響

不同菌株混菌試驗結果如表5所示。從植酸含量看,發酵7d時J-11與KG-109混菌發酵較優,植酸降解率達到84.98%,但到發酵14d時兩組合植酸含量差異不顯著,表明J-11與KG-109組合前期降解植酸速度較快,后期較慢,而R-02與KG109組合正好相反,但14天內的植酸降解效率兩者相當。可能是J-11為兼性厭氧菌在發酵初期含少量氧氣狀態下已經開始大量生長,R-02為厭氧菌在KG-109將氧氣耗盡后才能開始大量生長,故發酵前7d時 J-11與KG109混菌發酵植酸降解效果較好,而7天后的環境可能更適合R-02產生植酸酶。但從發酵工藝方面考慮,J-11的種子液培養需要3d,R-02種子液培養僅需1d,R-02能縮短整個發酵工藝的時間,在大規模發酵生產中能較好地發揮優勢。故選取R-02與KG109混菌進行正交優化試驗。

表5 不同菌株混菌發酵對發酵結果的影響

2.4 芝麻粕發酵條件正交優化

正交試驗設計及統計結果見表6,由表可知,4個因素對植酸含量的影響順序為:D>C>A>B,即對植酸含量影響最大的因素是發酵時間,接種量影響次之,溫度和接種比例影響最小,確定最佳水平為A2B3C2D3,即溫度30℃、R-02與 KG-109接種比例1∶2、接種量8%、時間10 d。經驗證試驗,此時植酸含量最低為0.07%,降解率達到87.60%。

4個因素對粗蛋白含量的影響順序為:C>B>D>A,即對植酸含量影響最大的因素是接種量,接種比例和發酵時間影響次之,溫度對粗蛋白含量影響最小,較優水平:A2B3C2D1溫度30℃、R-02與 KG-109接種比例1∶2、接種量8%、時間5 d。經驗證試驗,此時粗蛋白含量達到48.45%。

4個因素對酸溶蛋白含量的影響順序為:C>A>B>D,即對植酸含量影響最大的是接種量,溫度、接種比例和發酵時間影響較小,較優水平:A1B1C3D3溫度28℃、R-02與 KG-109接種比例2∶1、接種量10%、時間10 d。經驗證試驗,此時酸溶蛋白含量最高達到9.25%。

4個因素對揮發性鹽基氮含量的影響順序為:A>D>C>B,即對植酸含量影響最大的因素是溫度,發酵時間影響次之,接種量和接種比例影響最小,較優水平:A1B1C1D1溫度28℃、R-02與KG-109接種比例2∶1、接種量6%、時間5 d。此時揮發性鹽基氮含量最低為110.73 mg/100 g。

表6 正交試驗設計及統計結果

由表7正交試驗方差分析結果可知,接種量、時間對植酸含量影響達到了極顯著水平(P<0.01),溫度對植酸含量影響達到了顯著水平(P<0.05),R-02與KG-109接種比例對植酸含量影響不顯著(P>0.05);表明接種量和時間是影響植酸降解的最主要因素,溫度對植酸降解影響次之,R-02與KG-109接種比例對植酸降解幾乎沒有影響。在發酵過程中,接種量大,初始菌數較多,達到穩定期后總菌數也較多,其產生的植酸酶量也較多,植酸降解效果就顯著提高[20]。微生物達到穩定期后才大量產植酸酶,所以在一定范圍內時間越長,微生物產的植酸酶越多,植酸降解效果越顯著。

接種量對粗蛋白含量影響達到了顯著水平(P<0.05),溫度、R-02與KG-109接種比例、時間對粗蛋白含量影響不顯著(P>0.05);表明接種量是影響粗蛋白降解的最主要因素,溫度、R-02與KG-109接種比例、時間對粗蛋白降解影響較小。由于在發酵樣品測定時,芝麻粕中的粗蛋白和菌體蛋白測定的總值為樣品的粗蛋白含量,故接種量越高,菌體蛋白含量越高,樣品中粗蛋白含量也顯著提高。

溫度、R-02與KG-109接種比例、接種量、時間對酸溶蛋白含量影響不顯著(P>0.05);表明溫度、R-02與KG-109接種比例、接種量、時間對植酸降解影響較小。

溫度、接種量、時間對揮發性鹽基氮含量影響達到了極顯著水平(P<0.01),R-02與KG-109接種比例對植酸含量影響達到了顯著水平(P<0.05);表明溫度、接種量、時間是影響植酸降解的最主要因素,R-02與KG-109接種比例對植酸降解影響次之。隨著溫度、接種量的提高微生物分解能力提高,隨著時間延長,微生物不斷的分裂生長繼續將有機氮分解為無機氮,揮發性鹽基氮含量顯著提高。

表7 正交實驗方差分析結果

最優水平選定,以植酸為主要指標,其較優水平是溫度30℃、R-02與KG-109接種比例1∶2、接種量8%、時間10 d;但由表6可知,R-02與KG-109接種比例對植酸含量影響不顯著(P>0.05),結合粗蛋白、酸溶蛋白和揮發性鹽基氮的結果,R-02與KG-109接種比例為2∶1時酸溶蛋白含量較高、揮發性鹽基氮含量較低。故確定最優水平為溫度30℃、R-02與KG-109接種比例2∶1、接種量8%、時間10 d。這與試驗4組的試驗條件一致,在此條件下發酵后植酸含量為0.08%、粗蛋白含量為49.85%、酸溶蛋白為9.07%、揮發性鹽基氮為207.55 mg/100 g。

3 結論

R-02與KG-109混菌發酵芝麻粕優于單菌發酵。在溫度30℃、R-02與KG-109接種比例2∶1、接種量8%條件下,厭氧發酵10 d,植酸含量可降至0.08%,降解率達到86.21%。同時可提高粗蛋白和酸溶蛋白含量。

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ABSTRACTSingle factor and orthogonal experiment was used to optimize the fermentation condition to reduce the phytase content and increase the beneficial content such as crude protein and acid insoluble protein in the sesame meal.Sesame meal was used as raw materials to ferment with Bacillus Subtilis,Lactobacillus,and Saccharomycetes.The conditions for single factor experiment were as follows:the ratio of material to water was 1∶0.8(g∶mL),the additive amount of phytase was 0.20%,bacteria R-02 and KG-109 was mixed fermented.And the optimal fermentation conditions obtained via orthogonal test were as follows:the temperature was 30℃,the inoculation proportion of R-02 to KG-109 was 2∶1,the inoculation percentage was 8%and the fermentation time was 10 day.Under these fermentation conditions,the content and degradation rate of phytic acid were 0.08%and 86.21%,respectively.The content of crude protein,acid insoluble protein,and volatile basic nitrogen were 49.85%,9.07%and 207.55 mg/100g,respectively.

Key wordssesame meal,phytic acid,solid-state fermentation,optimize

Study on Strains Screening and Fermentation Conditions for Enhance Feed Quality of Sesame Meal

Peng Hui-hui1,Xu Ya-yuan2,Li Lv-mu1,3,Qian Kun4,Xu Fa-zhi3,Wu Dong4,Zhou Fen4,Ding Xiao-ling3
1(College of Tea & Food Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)
2(College of Life Science ,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)
3(College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)
4(Anhui Animal Biological Engineering Technology Research Center,Hefei 230031,China)

碩士研究生(李呂木研究員為通訊作者:llm56@ahau.edu.cn)

*安徽省長三角聯合科技攻關項目(10140702021);安徽省現代農業(肉禽)項目(2011)

2012-01-26,改回日期:2012-02-22

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